高倩 章文俊 楊國軍 潘曄 陳乃君 朱巍 金華偉

叉頭轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box O，F(xiàn)oxO）是 Forkhead蛋白大家族的一個亞群，哺乳動物中分別由4個截然不同的基因編碼組成 FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6，其中FoxO1主要表達在胰腺β細胞、肝細胞、脂肪細胞。FoxO1是一種多功能蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、衰老、分化、應激、自噬和代謝。目前研究發(fā)現(xiàn)FoxO1可抑制胰島α細胞向β細胞轉(zhuǎn)化、保護β細胞免受氧化應激損傷、維持β細胞終末分化狀態(tài)[1-2]。FoxO1的活性主要受磷酸化/去磷酸化水平調(diào)節(jié)，磷脂酰肌醇-3激酶（phospoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）信號通路是調(diào)節(jié)FoxO1磷酸化的主要上游信號通路[3]。渥曼青霉素是PI3K家族的強效抑制劑[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)小鼠胰島β細胞在高糖培養(yǎng)誘導下發(fā)生去分化，并發(fā)現(xiàn)磷酸化的FoxO1表達改變[5]，但迄今有關(guān)FoxO1活性抑制對高糖所致的小鼠胰島β細胞去分化影響的研究較少見。為進一步證實FoxO1活性抑制劑對胰島β細胞去分化的作用，筆者擬觀察FoxO1磷酸化抑制劑渥曼青霉素對高糖培養(yǎng)的小鼠胰島β細胞去分化的影響，以探討其作用機制，并為其進一步的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與細胞 小鼠胰島β細胞購自中南大學細胞室，HTCC編號：9號。渥曼青霉素（批號：200706，中國Solarbio公司），DMEM培養(yǎng)液（美國HyClone公司），胎牛血清（FBS）（澳大利亞Bovogen公司），磷酸化FoxO1（p-FoxO1）（位點：256）一抗、FoxO1、β 前體細胞標志物神經(jīng)元素3（neuroelement3，ngn3）和β細胞標志物胰島十二指腸同源盒-1（pancreatic duodenal homeobox-1，PDX1）一抗（中國Bioworld公司），HRP標記二抗（美國Jackson公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A）和 SYBR Premix Ex TapTM（RR420）（日本 TaKaRa 公司），Molecular Imager ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 小鼠胰島β細胞用10%FBS、葡萄糖濃度25mmol/L的DMEM培養(yǎng)液，置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d更換細胞培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 確定高糖培養(yǎng)刺激小鼠胰島β細胞FoxO1蛋白磷酸化最佳時間 采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）。小鼠胰島β細胞培養(yǎng)貼壁生長至100%融合后，更換為無血清培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24h，用60mmol/L高糖培養(yǎng)液進行干預，預定時間（0、12、24、48h）收集細胞，用預冷的含50mmol/L氟化鈉、1mmol/L釩酸鈉的細胞裂解液（使用前加入苯甲基磺酰氟）冰上裂解30min，收集裂解液，4℃，13 000rpm離心5min后收集上清液，BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度，操作按說明書。5×上樣緩沖液變性蛋白后-20℃保存。取40μg總蛋白上樣，用10%濃度的SDS-PAGE凝膠進行電泳。恒流將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉2h，分別加入p-FoxO1、FoxO1、β-actin一抗，4℃過夜，洗膜后分別加入相應的HRP標記的二抗，孵育后洗膜，ECL化學發(fā)光顯色，Molecular Imager ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)自動曝光掃描并用Image Lab軟件分析結(jié)果，以所測得的各條帶的吸光度與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值作為半定量值。通過比較不同時間點p-FoxO1和FoxO1蛋白表達水平，確定高糖培養(yǎng)刺激小鼠胰島β細胞FoxO1蛋白磷酸化最佳時間。

1.2.3 實驗分組 小鼠胰島β細胞培養(yǎng)貼壁生長至100%融合后，更換為無血清培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24h，再根據(jù)培養(yǎng)條件分為4組：（1）常規(guī)糖濃度（RG）組：用含25mmol/L葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；（2）高張濃度（RG+M）組：用含25mmol/L葡萄糖濃度和35mmol/L甘露醇的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為高張對照組；（3）高糖濃度（HG）組：用含60mmol/L葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為干預組；（4）高糖濃度+渥曼青霉素干預（HG+W）組：用含60mmol/L葡萄糖濃度和50nmol/L渥曼青霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為干預組。

1.2.4 各組小鼠胰島β細胞p-FoxO1、FoxO1蛋白表達水平檢測 經(jīng)不同培養(yǎng)液培養(yǎng)12h后（根據(jù)1.2.2確定得到），收集各組小鼠胰島β細胞，采用Western blot法（方法同1.2.2）檢測p-FoxO1、FoxO1蛋白表達情況。

1.2.5 各組小鼠胰島β細胞ngn3、PDX1蛋白和mRNA表達水平檢測 經(jīng)不同培養(yǎng)液培養(yǎng)72h后，收集各組小鼠胰島β細胞，采用Western blot法（方法同1.2.2）檢測ngn3、PDX1蛋白表達情況。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測ngn3、PDX1 mRNA表達情況，具體方法如下：采用Trizol法提取細胞總RNA，分光光度計檢測RNA濃度及純度，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Green熒光染料定量PCR擴增。引物設(shè)計采用Primer Premier 5.0軟件包。引物的特異性比對采用NCBI的Primer BLAST。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。實時熒光定量聚合酶鏈式反應法采用20μl體系，SYBR 熒光染料 10μl、上下游引物各 0.5μl、DEPC 水8μl、cDNA 1μl。以 β-actin 為內(nèi)參。各引物序列如下：ngn3 上游引物：5′-GCTCCGAAGCAGAAGTGG-3′，下游引物：5′-TTGTAAGTTTGGCGTCATCC-3′；PDX1 上游引物：5′-CTCCACCACCACCTTCCA-3′，下游引物：5′-GCTGTGTAAGCACCTCCTG-3′；β-actin 上游引物：5′-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，下游引物 5′-ATGTCACGCAGATTTCC-3′。用SYBR Green熒光染料定量聚合酶鏈式反應法分析，擴增條件為95℃預變性30s；隨后 95℃ 5s，60℃ 20s，40 個循環(huán)。采用相對定量 2-ΔΔCT計算基因表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；組內(nèi)不同時間點比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 確定高糖培養(yǎng)刺激小鼠胰島β細胞FoxO1蛋白磷酸化最佳時間 與0h比較，60mmol/L高糖培養(yǎng)12、24、48h后小鼠胰島β細胞p-FoxO1蛋白表達水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.01）；但 12、24、48h小鼠胰島β細胞p-FoxO1蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；提示高糖培養(yǎng)12h可以刺激小鼠胰島β細胞FoxO1信號分子發(fā)生磷酸化。與0h比較，60mmol/L高糖培養(yǎng)12、24、48h后小鼠胰島β細胞Fox－O1蛋白表達水平均無明顯改變，差異均無統(tǒng)計學意義（均 P＞0.05），見圖 1。

圖1 確定高糖培養(yǎng)刺激小鼠胰島β細胞FoxO1蛋白磷酸化最佳時間（a：各時間點細胞p-FoxO1和FoxO1蛋白表達的電泳圖；b：各時間點細胞p-FoxO1和FoxO1蛋白表達水平；與0h比較，*P＜0.01）

2.2 渥曼青霉素對高糖培養(yǎng)小鼠胰島β細胞p-Fox－O1、FoxO1蛋白的影響 與RG組比較，HG組小鼠胰島β細胞p-FoxO1蛋白表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；但RG組和RG+M組小鼠胰島β細胞p-FoxO1蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與HG組比較，HG+W組小鼠胰島β細胞p-FoxO1蛋白表達水平減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組小鼠胰島β細胞FoxO1蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），見圖 2。

圖2 渥曼青霉素對高糖培養(yǎng)小鼠胰島β細胞FoxO1磷酸化的影響（a：各組細胞p-FoxO1和FoxO1蛋白表達的電泳圖；b：各組細胞p-FoxO1和FoxO1蛋白表達水平；與RG組比較，*P＜0.01；與 HG 組比較，△P＜0.05）

2.3 渥曼青霉素對高糖培養(yǎng)小鼠胰島β細胞ngn3、PDX1蛋白和mRNA表達水平的影響 與RG組比較，HG組小鼠胰島β細胞ngn3蛋白和mRNA表達水平均明顯增加，PDX1蛋白和mRNA表達水平均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；但RG組和RG+M組小鼠胰島β細胞ngn3、PDX1蛋白和mRNA表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與HG組比較，HG+W組小鼠胰島β細胞ngn3蛋白和mRNA表達水平均明顯減少，PDX1蛋白和mRNA表達水平均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3。

3 討論

糖尿病的病因和發(fā)病機制極為復雜，至今未完全闡明。胰島素作為人體內(nèi)唯一的降糖激素，由胰島β細胞合成和分泌。目前研究認為，遺傳和環(huán)境因素共同作用導致胰島β細胞功能缺陷，最終導致糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[6]。對于β細胞減少的主要形式目前存在爭議：（1）β細胞發(fā)生凋亡；（2）β細胞發(fā)生去分化。過去一直認為β細胞凋亡是β細胞減少的主要形式，但是目前研究認為胰島β細胞去分化是導致β細胞衰竭的重要致病機制[7-8]。研究表明，在一定病理條件下胰島β細胞可去分化為內(nèi)分泌前體細胞[9]。PDX1為內(nèi)分泌細胞轉(zhuǎn)錄因子，是β細胞重要的基因表達，是反映胰島β細胞特征的重要標志物，ngn3與POU結(jié)構(gòu)域5類轉(zhuǎn)錄因子 1（Oct4）為內(nèi)分泌祖細胞標志物[10]。因此，本實驗選擇ngn3、PDX1作為觀察小鼠胰島β細胞是否發(fā)生去分化的指標。

圖3 渥曼青霉素對高糖培養(yǎng)小鼠胰島β細胞ngn3、PDX1蛋白和mRNA表達水平的影響（a：各組細胞ngn3蛋白表達的電泳圖；b：各組細胞ngn3和PDX1蛋白表達水平；c：各組細胞ngn3和PDX1 mRNA表達水平；與RG組比較，*P＜0.01；與HG組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

糖尿病狀態(tài)或高糖可誘導胰島β細胞去分化。本研究結(jié)果表明，小鼠胰島β細胞在60mmol/L高糖條件下培養(yǎng)72h后，β細胞標志物PDX1表達下降，而β前體細胞標志物ngn3表達升高，表明高糖環(huán)境能誘導小鼠胰島β細胞發(fā)生去分化，與劉嬋等[5]的研究結(jié)果一致，但是本實驗采取的高糖濃度為60mmol/L，遠高于劉嬋等采取的40mmol/L高糖濃度。

渥曼青霉素是一種PI3K家族的強效抑制劑，可抑制FoxO1的磷酸化，F(xiàn)oxO1 S256位點磷酸化后，F(xiàn)oxO1與伴侶蛋白14-3-3結(jié)合促進FoxO1向核外轉(zhuǎn)運，14-3-3蛋白封閉了核定位信號，阻止FoxO1向核內(nèi)轉(zhuǎn)運，使FoxO1不能與DNA結(jié)合區(qū)結(jié)合而失活[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)FoxO1基因敲除的小鼠在妊娠、多產(chǎn)等情況發(fā)生β細胞去分化，最終發(fā)展成糖尿病[10]。為了進一步探索FoxO1在高糖誘導β細胞去分化中的作用機制，筆者根據(jù)前期實驗結(jié)果，選擇在安全濃度范圍內(nèi)的濃度50nmol/L作為渥曼青霉素的實驗濃度，探討其對高糖培養(yǎng)胰島β細胞去分化影響。本實驗發(fā)現(xiàn)小鼠胰島β細胞在60mmol/L高糖條件下培養(yǎng)12h后出現(xiàn)FoxO1分子的磷酸化，并且該作用一直持續(xù)到48h，結(jié)合高糖能誘導小鼠胰島β細胞發(fā)生去分化，筆者繼續(xù)探索利用渥曼青霉素抑制FoxO1磷酸化能否抑制高糖誘導的小鼠胰島β細胞去分化。本實驗發(fā)現(xiàn)，渥曼青霉素同步干預后，渥曼青霉素能抑制高糖誘導的小鼠胰島β細胞去分化現(xiàn)象。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)渥曼青霉素能抑制高糖誘導的小鼠胰島β細胞去分化，渥曼青霉素可能通過抑制FoxO1的磷酸化而產(chǎn)生該抑制作用的。