陳通，陳煥詩(shī)，易軍飛

腰椎管狹窄癥（LSCS）是最常見的脊柱疾病之一。而黃韌帶（LF）肥大在LSCS的發(fā)生中起重要作用［1］。當(dāng)黃韌帶中彈性蛋白與膠原蛋白的比例降低時(shí)，彈性降低，僵硬或纖維化增加。這導(dǎo)致椎管狹窄，壓迫硬膜囊和神經(jīng)根，即使在沒(méi)有纖維環(huán)，突出的髓核或骨刺的情況下也會(huì)導(dǎo)致癥狀［2］。雖然黃韌帶的肥大和纖維化被認(rèn)為是由于衰老過(guò)程繼發(fā)的退行性變化和繼發(fā)于不穩(wěn)定性的機(jī)械應(yīng)力而發(fā)生的，但黃韌帶肥大的精確發(fā)病機(jī)制仍然未知［3］。以前的研究報(bào)道了各種分子在椎管狹窄病人中的表達(dá)和活性增加，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、miR-155、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白和炎性細(xì)胞因子［4］。例如，有研究表明黃韌帶成纖維細(xì)胞中活性MMPs（MMP-2和MMP-13）的表達(dá)增加可能與患有LSCS的病人的彈性蛋白降解和黃韌帶纖維化有關(guān)［5］。椎管狹窄病人的MMP-2和MMP-13值明顯高于椎間盤突出癥病人。其他研究表明，由黃韌帶成纖維細(xì)胞合成并增加膠原合成的TGF-β1與肥大有關(guān)［6］。之前有研究者探討了黃韌帶肥大與miRNA表達(dá)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-155在腰椎黃韌帶肥大病人中表達(dá)上調(diào)［7］。他們還報(bào)道了miR-155的表達(dá)水平與黃韌帶的纖維化厚度和程度相關(guān)［8］。DNA損傷和核堿基不穩(wěn)定也可能導(dǎo)致LSCS。氧化應(yīng)激是由促氧化劑和抗氧化劑穩(wěn)態(tài)失衡引起的，可能導(dǎo)致產(chǎn)生高水平的活性氧（ROS）。已知高水平的ROS會(huì)對(duì)人體細(xì)胞中的脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和DNA造成損害［9］。之前的研究證實(shí)LSCS病人在肥大性黃韌帶中的氧化性DNA損傷高于非病理性黃韌帶?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們預(yù)測(cè)肥大黃韌帶樣品中過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)的改變。過(guò)氧化氫酶在所有主要的身體器官中表達(dá)，尤其是肝臟，腎臟和紅細(xì)胞，并且在細(xì)胞防御氧化應(yīng)激中起重要作用。因此，我們假設(shè)缺乏過(guò)氧化氫酶，其催化過(guò)氧化氫進(jìn)入水和氧氣以保護(hù)生物免受自由基侵害，在黃韌帶肥大中起作用。已知自由基會(huì)破壞細(xì)胞和組織［10］，導(dǎo)致許多組織的感染［11］，智力下降，免疫力下降［12］，關(guān)節(jié)疾病，心臟?。?3］和纖維化。據(jù)我們所知，以前沒(méi)有研究過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)與黃韌帶肥大之間的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

這項(xiàng)回顧性研究于2013年1月至2015年12月間在柳州市柳鐵中心醫(yī)院脊柱科診所進(jìn)行。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.1 一般資料 研究對(duì)象包括75例L4-L5水平LSCS減壓性椎板切除術(shù)病人（LSCS組）和75例腰椎間盤突出癥對(duì)照組（LDH組），磁共振成像（MRI）無(wú)黃韌帶肥大的證據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)是先前的腰椎間盤手術(shù)，椎骨骨折，任何感染跡象，糖尿病，腫瘤或任何惡性腫瘤。椎管＜10 mm被認(rèn)為是椎管狹窄。所有手術(shù)均由本研究的筆者進(jìn)行。筆者和1名熟練的放射科醫(yī)師在矢狀位和軸位T1和T2加權(quán)MRI上確認(rèn)了LSCS和LDH。MRI在SIEMENSMR AEREA（1.5特斯拉）掃描儀上進(jìn)行。

1.2 樣品收集和黃韌帶厚度的測(cè)量 在手術(shù)干預(yù)期間獲得黃韌帶樣品，從所有病人獲得了整個(gè)黃韌帶樣本層。從黃韌帶樣本中除去硬膜外脂肪，使用卡尺測(cè)量最厚點(diǎn)，精確到0.01 mm。在2個(gè)不同的點(diǎn)測(cè)量黃韌帶厚度，并且使用最大厚度進(jìn)行分析。

1.3 組織學(xué)分析 將每個(gè)樣品的一半固定在4%中性甲醛中，并用20%乙二胺四乙酸脫鈣4～6周。接下來(lái)，將樣本包埋在石蠟中用于組織學(xué)分析。Masson三色染色用于評(píng)估纖維化程度，并且蘇木精和伊紅染色用于評(píng)估彈性蛋白降解。組織學(xué)分析由2位病理學(xué)家獨(dú)立完成。

1.4 Masson三色染色 對(duì)黃韌帶纖維化的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)表示正常組織，1級(jí)表示整個(gè)區(qū)域纖維化＜25%，2級(jí)表示整個(gè)區(qū)域纖維化25%～50%，3級(jí)表示50%～75%纖維化，4級(jí)表示＞75%纖維化。

1.5 蘇木精和伊紅染色 對(duì)黃韌帶彈性蛋白降解的程度進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)表示正常組織無(wú)彈力蛋白降解區(qū)，1級(jí)表示整個(gè)區(qū)域彈力蛋白降解率＜25%，2級(jí)表示25%至50%彈性蛋白降解，3級(jí)表示彈力蛋白降解50%～75%，4級(jí)表示彈力蛋白降解＞75%。

1.6 免疫組織學(xué)分析 對(duì)于免疫組織學(xué)染色，在切片機(jī)上切割連續(xù)切片，在二甲苯中脫蠟，并在醇溶液中再水合。接下來(lái)，在3 000 r/min時(shí)用胎牛血清對(duì)100 mg黃韌帶組織進(jìn)行勻漿（組織-Tearor，985370-04；BioSpec產(chǎn)品公司）。然后在裂解緩沖液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mm乙二胺四乙酸，50 mm 氯化鈉，0.02% 疊氮鈉（NaN3），1%nonidet P-40，0.25 mm二硫蘇糖醇）中裂解。在1 500轉(zhuǎn)/秒，4℃下離心30 min后，獲得上清液。為了分析每個(gè)樣品，將30μg蛋白質(zhì)加載到12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上。使用二辛可寧酸蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（Pierce BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒no 23225，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA；Pierce Company）測(cè)定裂解的黃韌帶組織的蛋白質(zhì)濃度。電泳后，使用轉(zhuǎn)移緩沖液將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至150 V的聚偏二氟乙烯膜（Millipore，St Quentin，Yvelines，F(xiàn)rance）2 h。在將非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉過(guò)夜后，將膜與對(duì)過(guò)氧化氫酶特異的純化兔多克隆抗體（兔抗過(guò)氧化氫酶；Cortex Biochem，CR2157RP，San Leandro，California）一起溫育。對(duì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）特異的小鼠抗體用作所有樣品的蛋白質(zhì)加載的內(nèi)部對(duì)照［GAPDH抗體（0411）：sc-47724］。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光（Amersham Life Sciences，Piscataway，NJ）使結(jié)果可視化。使用成像密度計(jì)GF670和分子分析軟件（Bio-Rad，SAFCBioscience，Sigma-Aldrich）對(duì)每個(gè)樣品3×量化印跡，并將平均值用作最終密度。密度表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（任意單位）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分類變量表示為平均值和范圍。Mann-WhitneyU檢驗(yàn)用于評(píng)估兩組之間黃韌帶彈性蛋白降解程度，纖維化程度和平均光密度（OD）的差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用SPSS 12.0版統(tǒng)計(jì)分析軟件（SPSSInc，Chicago，IL）分析所有數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較 兩組一般情況比較見表1，兩組在年齡（P＝0.850）或性別（P＝0.751）方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 黃韌帶樣品的厚度 在外科手術(shù)期間測(cè)量的平均黃韌帶厚度在LSCS組中為5.99mm（范圍為4.50～7.02 mm），在LDH組中為（2.95±0.6）mm，范圍為1.98～3.2 mm。LSCS組的平均黃韌帶厚度較高（5.99±0.86）mm，范圍為4.5～7.02 mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.004）。

表1 腰椎管狹窄（LSCS）75例和腰椎間盤突出癥（LDH）75例一般情況比較

2.3 彈性蛋白降解和黃韌帶的纖維化 在LDH（對(duì)照）病人中，組織學(xué)圖像顯示豐富的正常彈性蛋白纖維以嚴(yán)格平行或規(guī)則的排列組織。相比之下，在LSCS病人中，彈性蛋白降解程度非常高，蘇木精和伊紅染色顯示彈性纖維排列不規(guī)則。LSCS病人標(biāo)本中彈性蛋白降解的平均等級(jí)高于LDH病人，（3.04±0.50）比（0.79±0.60），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝7.997，P＝0.007）。LSCS病人標(biāo)本中平均纖維化分級(jí)高于LDH病人，（3.01±0.47）比（0.66±0.42），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝8.765，P＝0.005）

對(duì)病人組織進(jìn)行的免疫組織化學(xué)研究顯示，LDH組病人的組織中的陽(yáng)性染色成纖維細(xì)胞顯著低于LSCS組病人，（14.23±6.81）比（61.36±15.29），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝12.592，P＝0.001）。

2.4 過(guò)氧化氫酶表達(dá) 黃韌帶細(xì)胞培養(yǎng)上清液的明膠酶譜顯示LSCS病人樣品中過(guò)氧化氫酶活性持續(xù)降低。在從LDH病人獲得的黃韌帶細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中，觀察到較高的過(guò)氧化氫酶活性，使用GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。LSCS組的OD為（61.80±31.10），LDH組的OD為（152.80±41.13）。LSCS組的平均OD值低于LDH組（t＝15.196，P＝0.009）。

3 討論

黃韌帶覆蓋椎管的后壁和側(cè)壁。隨著黃韌帶變厚，椎管開始變窄并且神經(jīng)結(jié)構(gòu)被困在管內(nèi)［14］。在本研究中，手術(shù)期間進(jìn)行的測(cè)量顯示，LSCS病人的平均黃韌帶厚度高于LDH病人。我們還證明了大多數(shù)肥大黃韌帶樣本區(qū)域存在不規(guī)則排列，破裂，腫脹和減少的彈性纖維以及纖維化增加。先前報(bào)道過(guò)黃韌帶厚度，彈性喪失和纖維化評(píng)分之間的正相關(guān)關(guān)系［15］。我們的結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致，我們加入對(duì)照組可以加強(qiáng)這些發(fā)現(xiàn)。

此外，我們?cè)噲D確定哪些生化因子可能導(dǎo)致組織學(xué)變化和LSCS。已知過(guò)氧化氫酶在體內(nèi)各種結(jié)締組織中減少結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白和血管生成素的分泌。以前的研究表明過(guò)氧化氫酶的過(guò)表達(dá)可以防止纖維化［16］?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們假設(shè)缺乏過(guò)氧化氫酶可能在黃韌帶肥大中發(fā)揮作用。在本研究中，我們觀察到肥大黃韌帶樣品的血管周圍區(qū)域中過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)降低。眾所周知，過(guò)氧化氫酶可保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激［17］。過(guò)氧化氫酶活性的降低導(dǎo)致異常的上皮修復(fù)，上皮損傷與纖維化發(fā)展過(guò)程中過(guò)氧化氫酶的功能缺陷有關(guān)［18］。有報(bào)道稱細(xì)胞外ROS增加基質(zhì)沉積并導(dǎo)致細(xì)胞纖維化增加［14］。ROS也被稱為反應(yīng)性化學(xué)實(shí)體，廣泛參與細(xì)胞信號(hào)傳遞、代謝、存活和凋亡，從而調(diào)節(jié)許多生理和病理過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、纖維化、收縮/擴(kuò)張和炎癥［20］。因此，我們的結(jié)果提示，缺乏過(guò)氧化氫酶，消除了ROS，可能參與了黃韌帶肥大的機(jī)制，從而導(dǎo)致LSCS。這是關(guān)于過(guò)氧化氫酶和黃韌帶肥大之間關(guān)系的第一項(xiàng)研究，可能提出了LSCS的新治療策略。

本研究表明彈性蛋白降解和纖維化增加與黃韌帶肥大密切相關(guān)，這與過(guò)去的研究一致。此外，我們報(bào)道了LSCS病人缺乏過(guò)氧化氫酶，這是一種抗氧化酶。我們希望這些新發(fā)現(xiàn)為未來(lái)的研究打開一扇門。