蘇華振，魏明

急性肺損傷（ALI）是一類較多見(jiàn)的危急重病，可能進(jìn)展成為更加危急的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。病因眾多，其死亡率能夠達(dá)到40%［1-2］。當(dāng)前研究認(rèn)為其發(fā)病的主要因素為不可控制的炎性反應(yīng)［3］。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的激活在ALI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。RAS的主要效應(yīng)因子血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）有顯著的促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用，它是介導(dǎo)ALI肺部炎性反應(yīng)過(guò)程的關(guān)鍵因子［4-5］。作為血管緊張素Ⅱ的1型受體阻斷劑，氯沙坦能夠顯著降低肺部炎癥損傷水平［6］。樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）能夠調(diào)節(jié)肺部免疫反應(yīng)，并在其中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。有研究表明，肺部組織感染以及由博來(lái)霉素誘發(fā)的肺部損傷過(guò)程都有肺DC的干預(yù)［7-8］。肺部結(jié)構(gòu)RAS能夠調(diào)節(jié)肺DC的作用水平，AngⅡ可促進(jìn)DC分化成熟［9］。但是氯沙坦能否依賴于抑制AngⅡ誘發(fā)的肺DC的激活從而緩解肺部組織炎性反應(yīng)這仍有待于深究。此實(shí)驗(yàn)應(yīng)用脂多糖（LPS）來(lái)構(gòu)建ALI小鼠的模型，研究在ALI中氯沙坦對(duì)肺DC的數(shù)目和功能的作用，從而深入探究氯沙坦對(duì)ALI產(chǎn)生的保護(hù)性機(jī)制。本研究符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2016年10月至2018年12月于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買72只C57BL/6小鼠，雄性，6～8周，體質(zhì)量為18～22 g。許可證號(hào)：ZYXK（豫）2016-0289。在無(wú)特定病原體（SPF級(jí)）條件下常規(guī)喂養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)化顆粒飼料、飲用水、墊料及其他相關(guān)物品都經(jīng)滅菌處理。本研究符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 試劑和器材 脂多糖（E.coli 0111：B4）購(gòu)自Sigma公司，膠原酶V購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。小鼠CD11c、CD11b，組織相容性復(fù)合物（MHC Ⅱ），CD80及同型對(duì)照單克隆抗體都購(gòu)自eBioscience公司。Losartan由Cayman公司提供。小鼠IL-6 ELISA kit購(gòu)自上海依科賽生物有限公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司（BDFACSCaliburTM）。

1.3 模型制備與分組 將72只SD小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對(duì)照組、ALI模型組和氯沙坦干預(yù)組，各24只。健康對(duì)照組：向小鼠腹腔中注射50μL的PBS，30 min后向氣管中滴加30 μL的PBS；ALI模型組［10-11］：向小鼠腹腔中注射50 μL的PBS，30 min之后向氣管中滴加2 mg/kg的脂多糖（溶于30μL PBS中）。成功構(gòu)建脂多糖（LPS）-ALI模型的標(biāo)準(zhǔn)：肺部組織間質(zhì)內(nèi)充血、腫大，肺泡之間的間隙顯著增寬，肺部組織間質(zhì)以及肺泡腔中有彌漫性炎癥細(xì)胞的包裹、出血，大部分肺泡結(jié)構(gòu)萎縮［11］。氯沙坦干預(yù)組：向小鼠腹腔中注射15 mg/kg的氯沙坦（溶于50 μL PBS中），30 min之后構(gòu)建脂多糖（LPS）-ALI模型。注射脂多糖或者PBS之后的6、12、24 h左右處死標(biāo)本，留取待檢的肺組織。

1.4 標(biāo)本的采集以及病理研究 于6、12、24 h采用右心室取血的方法處死小鼠（n＝6只小鼠/組/時(shí)間點(diǎn)）。將右肺部分組織（約0.5 cm×0.5 cm，1～2 g）進(jìn)行甲醛固定、石蠟片包埋、再經(jīng)切片、HE染色，由病理科一名醫(yī)師專門負(fù)責(zé)觀測(cè)其病理改變，并將組織小塊按照方法［12］對(duì)其進(jìn)行損傷分級(jí)評(píng)分。規(guī)則如下：①肺泡的充血；②出血；③肺泡腔中或者血管壁上有中性粒細(xì)胞的包裹；④肺泡壁加厚和（或）有透明質(zhì)膜的產(chǎn)生四項(xiàng)指標(biāo)，分別按照病變的嚴(yán)重程度對(duì)其評(píng)0～4分（0分：沒(méi)有病理改變或極度輕微病變，1分：輕微病理改變，2分：中等程度病理改變，3分：嚴(yán)重病理改變，4分：極度重癥病理改變）。各部分的評(píng)分?jǐn)?shù)之和即為急性肺損傷的總分?jǐn)?shù)。

1.5 肺單細(xì)胞懸液制備 在滅菌的情況下拿出肺部組織30 mg，將其放于含有Hank′s平衡溶液的培養(yǎng)皿之中，把取到的肺部組織用眼科剪裁成1 mm×1 mm×1 mm大小的小塊，把裝有肺部組織小塊的培養(yǎng)皿放于培養(yǎng)箱中，勇膠原酶V溶液對(duì)其進(jìn)行消化1 h（37℃，每隔3 min輕輕振搖數(shù)次），冰浴終止消化，緩緩吸打分離細(xì)胞，用200目的不銹鋼網(wǎng)格過(guò)篩，在EP管中集中收取消化液。再經(jīng)1 000 r/min的速度離心10 min，去上清，于下層沉淀中注入2 mL的PBS緩緩吸打，相同的速度離心5 min，棄上清，于沉淀里加5 mL的紅細(xì)胞裂解液，緩緩吸打使細(xì)胞分散開(kāi)來(lái)，冰塊上靜置10 min，相同的速度離心10 min，棄上清，加3 mL的PBS混合版均勻，離心5 min，速度同上。棄上清。用臺(tái)盼藍(lán)染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)板涂片，光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)活體細(xì)胞數(shù)目，之后將細(xì)胞的濃度調(diào)整到1×106/mL，冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 肺濕重/體質(zhì)量（LW/BW）檢測(cè) 取肺組織，把肺部組織表層多余的水分用吸水紙吸盡同時(shí)清理好血漬之后，稱量并算出肺組織LW/BW水平。

1.7 ELISA測(cè)定肺部組織IL-6水平 挑選右肺下部組織約10 mg，加入2 mL生理鹽水，用電動(dòng)勻漿機(jī)制備肺組織勻漿，4℃，3 000 r/min離心10 min，留上清液，-80℃保存。按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行嚴(yán)格規(guī)范操作，450 nm處測(cè)吸光值，計(jì)算IL-6水平。

1.8 流式細(xì)胞儀測(cè)定肺部DC數(shù)目以及CD80、主要組織相容性復(fù)合物（MHC）Ⅱ的表達(dá) 在管中滴加0.5μg的抗CD16/CD32單克隆抗體避光反應(yīng)10 min，在相對(duì)應(yīng)的管中分別滴加0.25μg的抗CD11c-FITC單抗、0.125μg的CD11b-PE單抗、0.03μg的抗MHCⅡ-APC單抗以及0.06μg的抗CD80-APC單抗。并將FITC熒光標(biāo)記的抗亞美尼亞倉(cāng)鼠IgG、PE熒光標(biāo)記的抗大鼠IgG2b、APC熒光標(biāo)記的抗大鼠IgG2b設(shè)為同型的陰性對(duì)照管（抗體在使用之前應(yīng)該緩慢搖勻），混合均勻，25℃避光反應(yīng)20 min。1 200 r/min的速度離心5 min，棄去上層清液，向沉淀中滴加1 mL的含有1%BSA PBS混合均勻，同樣的速度離心5 min，棄去上層清液，滴加1%的多聚甲醛300μL，放于4℃避光存放，24 h之內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)之前應(yīng)該緩慢吸打，使細(xì)胞混合均勻，本研究重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以±s表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，行秩和檢驗(yàn)、重復(fù)測(cè)量方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯沙坦對(duì)小鼠肺部結(jié)構(gòu)病理學(xué)變化產(chǎn)生的效果 6 h各組肺部結(jié)構(gòu)切片進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。健康對(duì)照組中小鼠的肺泡間隙均等，肺泡腔中沒(méi)有明顯的滲出以及炎癥性包裹。ALI模型組小鼠的肺部組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)其肺泡間隙顯著加寬、肺間質(zhì)內(nèi)血管有充血、出血同時(shí)彌漫的炎癥性包裹。氯沙坦干預(yù)組中小鼠肺部病理學(xué)檢查可見(jiàn)肺泡間隔稍稍加寬，產(chǎn)生少部分出血以及炎癥性包裹，與ALI模型組相比損傷大大降低。見(jiàn)圖1，2。

2.2 氯沙坦對(duì)小鼠肺LW/BW比的影響 6 h、12 h和24 h各組小鼠肺LW/BW比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與健康對(duì)照組相比，ALI模型組和氯沙坦干預(yù)組小鼠肺LW/BW升高（P＜0.05）；氯沙坦干預(yù)組肺LW/BW較ALI模型組降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 氯沙坦對(duì)小鼠肺LW/BW比的影響/（%，±s）

表1 氯沙坦對(duì)小鼠肺LW/BW比的影響/（%，±s）

注：LW/BW為肺濕重/體質(zhì)量，ALI為急性肺損傷；與健康對(duì)照組比較，a P＜0.05；與ALI模型組比較：b P＜0.05

24 h 0.50±0.03 0.67±0.05 a 0.58±0.06 ab 5.73 0.005組別健康對(duì)照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值鼠數(shù)24 24 24 6 h 0.49±0.03 0.71±0.04a 0.63±0.04ab 6.38 0.003 12 h 0.51±0.04 0.69±0.05a 0.61±0.03ab 5.96 0.005

2.3 氯沙坦對(duì)小鼠肺Smith損傷評(píng)分的影響 6 h、12 h和24 h，與健康對(duì)照組相比，ALI模型組和氯沙坦干預(yù)組小鼠肺組織病理切片評(píng)分增高（P＜0.05）；氯沙坦干預(yù)組肺損傷評(píng)分較ALI模型組明顯降低（P＜0.05）見(jiàn)表2。

表2 氯沙坦對(duì)小鼠肺Smith損傷評(píng)分的影響/（分，±s）

表2 氯沙坦對(duì)小鼠肺Smith損傷評(píng)分的影響/（分，±s）

注：ALI為急性肺損傷；與健康對(duì)照組比較，a P＜0.05；與ALI模型組比較，b P＜0.05

24 h 0.57±0.19 5.31±0.21 a 3.27±0.33 ab 121.38 0.003組別健康對(duì)照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值鼠數(shù)24 24 24 6 h 0.66±0.23 5.56±0.22a 3.98±0.21ab 127.24 0.003 12 h 0.61±0.20 5.49±0.19a 3.89±0.28ab 118.67 0.004

2.4 氯沙坦對(duì)小鼠肺組織勻漿IL-6水平的影響比較6 h、12 h和24 h各組小鼠肺組織勻漿IL-6含量，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝12.34、14.28和16.49，P＝0.004、0.003和0.002）。6 h、12 h和24 h ALI模型組小鼠肺組織勻漿中IL-6含量與健康對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與ALI模型組比較，氯沙坦干預(yù)組IL-6含量降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.5 氯沙坦對(duì)小鼠肺組織DC數(shù)量的影響 6 h、12 h和24 h各組小鼠肺組織DC數(shù)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝17.64、14.21和12.76，P＝0.003、0.004和0.005）。與健康對(duì)照組比較，ALI模型組肺組織DC數(shù)量和氯沙坦干預(yù)組肺組織DC數(shù)量均顯著升高（P＜0.05）。ALI模型組與氯沙坦干預(yù)組肺組織DC數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表3 氯沙坦對(duì)小鼠肺IL-6水平的影響/（pg/mg，±s）

表3 氯沙坦對(duì)小鼠肺IL-6水平的影響/（pg/mg，±s）

注：ALI為急性肺損傷；IL-6為白細(xì)胞介素-6；與健康對(duì)照組比較，a P＜0.05；與ALI模型組比較，b P＜0.05

24 h 355±108 3 018±264a 1 786±153ab 16.49 0.002組別健康對(duì)照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值鼠數(shù)24 24 24 6 h 396±96 2 864±185a 2 135±193ab 12.34 0.004 12 h 341±72 3 568±369a 2 539±238ab 14.28 0.003

表4 氯沙坦對(duì)小鼠肺樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量的影響/（%，±s）

表4 氯沙坦對(duì)小鼠肺樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量的影響/（%，±s）

注：ALI為急性肺損傷；與健康對(duì)照組比較，a P＜0.05；與ALI模型組比較，b P＞0.05

24 h 1.11±0.35 3.48±0.45a 3.29±0.33ab 12.76 0.005組別健康對(duì)照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值鼠數(shù)24 24 24 6 h 1.14±0.22 3.18±0.43a 2.96±0.37ab 17.64 0.003 12 h 1.09±0.31 3.34±0.37a 3.15±0.33ab 14.21 0.004

2.6 氯沙坦對(duì)小鼠肺部組織DC表達(dá)CD80的作用 6 h、12 h和24 h各組小鼠肺組織DC表達(dá)CD80比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝12.42、16.58和21.37，P＝0.006、0.004和0.002）。與健康對(duì)照組比較，ALI模型組和氯沙坦干預(yù)組肺DC表達(dá)CD80均升高（P＜0.05）。ALI模型組肺DC表達(dá)CD80明顯高于氯沙坦干預(yù)組（P＜0.05），見(jiàn)表5和圖3。

2.7 氯沙坦對(duì)小鼠肺組織DC表達(dá)MHCⅡ的影響 6 h、12 h和24 h各組小鼠肺組織DC表達(dá)MHCⅡ比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1.45、1.68和1.35，P＝0.068、0.061和0.072）。與健康對(duì)照組比較，ALI模型組肺DC表達(dá)MHCⅡ和氯沙坦干預(yù)組肺DC表達(dá)MHCⅡ差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），健康對(duì)照組和氯沙坦干預(yù)組肺DC表達(dá)MHCⅡ差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表6和圖4。

表5 氯沙坦對(duì)小鼠肺樹(shù)突狀細(xì)胞功能狀態(tài)的影響/（%，±s）

表5 氯沙坦對(duì)小鼠肺樹(shù)突狀細(xì)胞功能狀態(tài)的影響/（%，±s）

注：ALI為急性肺損傷；與健康對(duì)照組比較，a P＜0.05；與ALI模型組比較，b P＜0.05

24 h 3.52±0.98 12.43±3.07a 9.24±3.01ab 21.37 0.002組別健康對(duì)照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值鼠數(shù)24 24 24 6 h 3.51±0.94 9.78±2.37a 7.41±2.64ab 12.42 0.006 12 h 3.56±1.02 10.56±2.69a 8.59±2.86ab 16.58 0.004

表6 氯沙坦對(duì)小鼠肺樹(shù)突狀細(xì)胞抗原提呈功能的影響/（%，±s）

表6 氯沙坦對(duì)小鼠肺樹(shù)突狀細(xì)胞抗原提呈功能的影響/（%，±s）

注：ALI為急性肺損傷；與健康對(duì)照組比較，a P＞0.05；與ALI模型組比較，b P＞0.05

24 h 82.33±17.52 80.27±18.16a 79.39±18.05ab 1.35 0.072組別健康對(duì)照組ALI模型組氯沙坦干預(yù)組F值P值鼠數(shù)24 24 24 6 h 81.31±16.94 78.24±18.23a 78.98±18.56ab 1.45 0.068 12 h 83.67±18.15 79.61±17.59a 80.14±18.34ab 1.68 0.061

3 討論

因?yàn)檠装Y感染等多種原因使肺部多種炎性因子激活，從而使肺部組織的免疫反應(yīng)失去控制是ALI發(fā)生的主要原因［13-14］。與此同時(shí)，缺少特異性藥物的治療成為影響其病情發(fā)展以及預(yù)后主要因素之一［15］。有研究［16］顯示，肺部RAS系統(tǒng)的活躍狀態(tài)在整個(gè)ALI的免疫紊亂中起到非常關(guān)鍵的作用。也有研究［6］顯示，氯沙坦可以顯著降低ALI肺部的炎性損傷，這揭示了其在ALI的臨床治療上可能具有重要的應(yīng)用價(jià)值。而探究氯沙坦對(duì)ALI肺部免疫紊亂造成的炎性損傷機(jī)制有極其重大的意義。

本研究應(yīng)用向氣管內(nèi)注射脂多糖復(fù)制構(gòu)建小鼠ALI模型，來(lái)重現(xiàn)由于肺部炎癥感染所致ALI的整個(gè)過(guò)程。本研究可見(jiàn)：ALI模型組小鼠肺LW/BW顯著升高，肺部切片能夠看到肺泡間隙加寬、肺部充血、出血以及彌漫性的炎性細(xì)胞的包裹，且IL-6水平也有顯著的增高，這都表明ALI模型復(fù)制成功［17］。本研究還可見(jiàn)到：與ALI模型組比較，經(jīng)氯沙坦干預(yù)的小組LW/BW降低，肺部組織免疫損傷有所緩解，肺損傷的評(píng)分顯著降低，并且肺IL-6水平也明顯減低，提示氯沙坦能夠緩解肺部損傷。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，經(jīng)氯沙坦干預(yù)組的小鼠肺部炎癥損傷水平依舊較高，提示氯沙坦對(duì)ALI產(chǎn)生部分保護(hù)的效果。

在肺部免疫系統(tǒng)的防御和保護(hù)中，肺DC都起到了非常重要的作用，其數(shù)目和功能與免疫效能的發(fā)揮有著相當(dāng)密切的聯(lián)系［18］。目前已知的肺部感染，慢性阻塞性肺疾病以及支氣管哮喘等肺部炎性病變的產(chǎn)生與發(fā)展都有肺DC的參與［19］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALI小鼠的肺DC有廣泛積聚現(xiàn)象，其中其表達(dá)的CD80水平也顯著升高，這些均提示在ALI肺部炎性反應(yīng)中，都有成熟的肺DC的身影。且在調(diào)節(jié)ALI肺部免疫損傷這一過(guò)程中，肺DC可能成為其重要靶點(diǎn)。健康對(duì)照組與ALI模型組小鼠肺DC表的達(dá)MHCⅡ分子水平都相對(duì)較高，并且沒(méi)有顯著差異，提示ALI小鼠肺DC的抗原遞呈能力沒(méi)有很大改變。機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)的種類以及水平可能是由其DC的數(shù)目和功能來(lái)決定的。有研究［7］顯示，由博來(lái)霉素誘發(fā)的小鼠肺損傷模型中肺部成熟DC數(shù)目有明顯升高并且其同時(shí)還參與肺部免疫反應(yīng)，阻礙肺DC的發(fā)育成熟能夠明顯緩解肺部的炎性損傷及其纖維化。

本研究證明：經(jīng)氯沙坦干預(yù)小組對(duì)脂多糖（LPS）-ALI小鼠肺DC數(shù)目沒(méi)有太大影響，但是表達(dá)CD80的肺DC比例顯著降低，揭示了氯沙坦能夠通過(guò)阻礙肺DC成熟緩解ALI肺部免疫損傷水平。氯沙坦對(duì)ALI肺DC表達(dá)的MHCⅡ分子不產(chǎn)生顯著影響，提示了氯沙坦可能對(duì)DC的抗原遞呈功能沒(méi)有明顯影響。也有研究［9］發(fā)現(xiàn)，氯沙坦能夠顯著減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦以及脊髓中的免疫損傷主要是依賴于對(duì)其組織中DC的激活和成熟的抑制。這也更加深入地說(shuō)明了氯沙坦能夠通過(guò)阻礙DC成熟從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ALI的免疫調(diào)節(jié)。

綜上所述，氯沙坦能夠通過(guò)抑制肺DC的發(fā)育成熟從而調(diào)節(jié)ALI肺部免疫損傷，在治療ALI的臨床手段上可能具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

（本文圖1～4見(jiàn)插圖4-1）

圖1 氯沙坦對(duì)6h小鼠肺組織病理變化的影響（HE×200）：1A為健康對(duì)照組，1B為急性肺損傷模型組，1C為氯沙坦干預(yù)組（箭頭所示為中性粒細(xì)胞）

圖2 急性肺損傷模型組6h肺部組織的標(biāo)志性病理變化（HE×400）：2A為肺泡間隔增寬，其內(nèi)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞包裹，2B為血管壁和肺泡腔內(nèi)中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞大規(guī)模侵襲（箭頭所示為中性粒細(xì)胞），2C為肺泡腔中有出血，2D為肺部小血管充血、滲出

圖3 氯沙坦對(duì)6h小鼠肺組織CD80的影響：3A為健康對(duì)照組，3B為急性肺損傷模型組，3C為氯沙坦干預(yù)組

圖4 氯沙坦對(duì)6h小鼠肺組織主要組織相容性復(fù)合物（MHC）Ⅱ的影響：4A為健康對(duì)照組，4B為急性肺損傷模型組，4C為氯沙坦干預(yù)組