李 浩，方 乾，任 發(fā)，代貴超，王立強(qiáng)，胡建宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

精原干細(xì)胞(SSCs)的研究對(duì)于畜牧生產(chǎn)有著重要的意義，但是因其細(xì)胞數(shù)量較少以及增殖較慢，嚴(yán)重制約了SSCs的相關(guān)研究[1]。而細(xì)胞因子的添加能夠調(diào)節(jié)SSCs的增殖、分化以及細(xì)胞功能的維持[2]。通過(guò)研究相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)SSCs在體外培養(yǎng)過(guò)程中的影響，對(duì)于進(jìn)一步改進(jìn)SSCs體外長(zhǎng)期培養(yǎng)體系有著重要意義。

表皮調(diào)節(jié)素(Epiregulin)作為表皮生長(zhǎng)因子家族中的成員之一，能夠促進(jìn)多種組織細(xì)胞DNA合成，可以通過(guò)P13K/AKT等通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移，促進(jìn)炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)和調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育[3-6]。目前關(guān)于Epiregulin對(duì)精原干細(xì)胞的影響的相關(guān)研究較少，僅有Shiraishi等發(fā)現(xiàn)其在精子發(fā)生受阻的曲細(xì)精管中發(fā)生非顯著上調(diào)[7]，而Epiregulin對(duì)SSCs在體外培養(yǎng)過(guò)程中的影響尚未有相關(guān)研究。上皮有絲分裂原(Epigen)作為一種表皮生長(zhǎng)因子受體的配體，能夠激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和表皮生長(zhǎng)因子受體激酶蛋白1(c-ErbB-1)的磷酸化發(fā)揮促分裂作用[8]，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和遷移活動(dòng)[9]。Epigen在小鼠睪丸和肝臟組織中的表達(dá)顯著高于其他組織[10]，但目前尚未有相關(guān)研究揭示Epigen在睪丸組織細(xì)胞中的功能。干細(xì)胞因子(SCF)是能夠與c-KIT受體(CD117)結(jié)合的細(xì)胞因子[11]，能夠調(diào)控血細(xì)胞的生成、精子發(fā)生和黑色素生成，可以引導(dǎo)原始生殖細(xì)胞(PGCs)、精原細(xì)胞和原始卵母細(xì)胞的細(xì)胞遷移活動(dòng)[12]。而相關(guān)研究表明，SCF在胚胎干細(xì)胞、PGCs、生殖干細(xì)胞的自我更新和分化過(guò)程中也起著關(guān)鍵的作用[13-14]。

一些能夠在體外培養(yǎng)過(guò)程中調(diào)控SSCs增殖的細(xì)胞因子例如GDNF、bFGF等，目前已經(jīng)得到較深入的研究，但是SSCs增殖慢的問(wèn)題仍未解決[1-2]。因此發(fā)現(xiàn)其他能夠調(diào)控SSCs增殖與分化的細(xì)胞因子具有重要意義。本研究在添加Epiregulin、Epigen和SCF的情況下，對(duì)山羊SSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)、細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)。以揭示其對(duì)山羊SSCs在體外培養(yǎng)條件下的作用，為其他哺乳動(dòng)物的SSCs長(zhǎng)期體外培養(yǎng)體系提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)山羊睪丸采自陜西富平某奶山羊?qū)I(yè)合作社，睪丸采自6只60～70 d的關(guān)中奶山羊，采集山羊睪丸表面消毒后置于含有5 % 青鏈霉素雙抗的PBS中，并儲(chǔ)存在冰盒內(nèi)，并于2 h 之內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 山羊精原干細(xì)胞提取與富集

在超凈臺(tái)內(nèi)消毒睪丸表面后放置于10 cm 一次性培養(yǎng)皿中，剝離睪丸鞘膜、附睪、白膜，剪去中心部分的結(jié)締組織，將剩余睪丸組織剪成小于1 mm2的組織塊。組織碎塊用含100 IU/mL 雙抗的PBS沖洗三次。使用2 mg/mL IV膠原酶和2 mg/mL的透明質(zhì)酸酶，37 ℃震蕩消化組織25 min。消化后使用PBS重懸并使其自然沉降1～2 min，吸取有懸浮曲細(xì)精管組織上清液，重復(fù)5～10次。離心收集曲細(xì)精管碎片，使用0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞。

收集細(xì)胞接種于多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的一次性培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中差速貼壁2 h，重復(fù)3次。收集未貼壁細(xì)胞接種于含有山羊成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的6孔板中，使用SSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)基(High Glucose DMEM、1% FBS、1% 青鏈霉素、1% 非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺、0.1% 2-巰基乙醇、20 ng/mL GDNF、10 ng/mL bFGF以及10 ng/mL LIF)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 山羊精原干細(xì)胞的鑒定

對(duì)富集前后的SSCs進(jìn)行CD9、GFRA1免疫熒光鑒定。細(xì)胞匯合度達(dá)到50%左右時(shí)，用PBS浸洗3次后用4%的多聚甲醛固定15 min。PBS浸洗3次洗去剩余多聚甲醛，使用0.5 % Triton X-100 20 ℃通透20 min。通透后的細(xì)胞使用山羊血清，20 ℃ 封閉30 min。封閉完成后加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日用PBST 浸洗3次后加入稀釋好的熒光二抗，20～37 ℃ 孵育1 h。孵育完成后使用PBST浸洗三次后，加入DAPI再孵育5 min，洗去DAPI后加入封片液，在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.4 山羊精原干細(xì)胞的收集

在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)14 d 后，利用0.05 % 胰酶消化精原干細(xì)胞克隆團(tuán)，收集細(xì)胞差速貼壁2 h進(jìn)行二次富集。富集后吹打數(shù)次后使未貼壁細(xì)胞懸浮，收集剩余未貼壁的精原干細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的檢測(cè)

收集的SSCs以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接于24孔板內(nèi)培養(yǎng)，SSCS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加20 ng/mL Epiregulin、20 ng/mL SCF、20 ng/mL 和100 ng/mL 的Epigen進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)預(yù)留空白對(duì)照組。每48 h使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)每組細(xì)胞計(jì)數(shù)，重復(fù)3孔。

1.6 CCK-8法對(duì)干細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)

收集的SSCs接入96孔板，每孔接種約2.5×103個(gè)細(xì)胞，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加20 ng/mL Epiregulin、20 ng/mL Epigen、 100 ng/mL Epigen和20 ng/mL SCF。每組5個(gè)重復(fù)，37 ℃、5 % CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并預(yù)留空白孔。每隔72 h 使用 90 μL DMEM以及10 μL CCK-8染色液進(jìn)行孵育染色。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下各組平均OD值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)組均設(shè)計(jì)3次重復(fù)。細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活性的結(jié)果表示為“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”，數(shù)據(jù)采用Statistical Product and Service Solutions (SPSS)19.0進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)顯著性差異，其中P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊精原干細(xì)胞提取與鑒定

通過(guò)兩次差速貼壁富集獲取的曲細(xì)精管細(xì)胞，去除了部分雜細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)混雜度得到降低。差異貼壁后細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)鑒定結(jié)果顯示(圖1)，富集后的曲細(xì)精管細(xì)胞經(jīng)過(guò) 7 d 培養(yǎng)后，具有較多的CD9和GFRA1陽(yáng)性細(xì)胞，表明通過(guò)兩次差速貼壁獲得了純度較高的山羊SSCs。

2.2 精原干細(xì)胞的培養(yǎng)以及收集

培養(yǎng)3 w的山羊SSCs形成了較多的SSCs小克隆團(tuán)(圖2)，山羊SSCs貼壁性弱于飼養(yǎng)層，通過(guò)低濃度胰酶的消化和差速貼壁能夠富集培養(yǎng)的SSCs。SSCs培養(yǎng)體系能夠長(zhǎng)期體外培養(yǎng)SSCs，得到SSCs克隆團(tuán)，能夠?yàn)橄乱徊皆囼?yàn)提供較為豐富的SSCs。

圖2SSCs經(jīng)過(guò)1w(圖A)、2w(圖B)
和3w(圖C)培養(yǎng)的克隆團(tuán)形態(tài)(Bar=100μm)
箭頭指向?yàn)樯窖騍SCs克隆團(tuán)
Fig. 2 The goat SSCs after 1, 2 and 3 (A, B, C) weeks of
culture(Bar=100 μm)Arrows pointing to the goat SSCs clone

2.3 Epiregulin、Epigen和SCF對(duì)山羊精原干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

SSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖3，添加100 ng/mL Epigen的處理組，其細(xì)胞數(shù)量4 d 開(kāi)始高于其他處理組及對(duì)照組(P>0.05)。添加 100 ng/mL Epigen和20 ng/mL Epiregulin的處理組細(xì)胞數(shù)自第6 d 開(kāi)始顯著高于其他組(P<0.05)。至第12 d 添加100 ng/mL Epigen、20 ng/mL Epiregulin以及 20 ng/mL SCF的處理組細(xì)胞數(shù)顯著高于其余兩組(P<0.05)。

2.4 Epiregulin、Epigen和SCF對(duì)山羊精原干細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞活力見(jiàn)圖4，相比于對(duì)照組，添加100 ng/mL Epigen、20 ng/mL Epiregulin的處理組第6 d 時(shí)顯著高于其余兩組(P>0.05)，而在第9 d 和第12 d 時(shí)20 ng/mL Epiregulin處理組其細(xì)胞活力均顯著高于其他組(P<0.05)，而100 ng/mL Epigen組除顯著低于Epiregulin處理組外，顯著高于其余組(P<0.05)。

圖3添加Epigen,Epiregulin和SCF的SSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)
Fig. 3 The proliferation curve of SSCs cultured with Epigen, Epiregulin and SCF

3 討 論

在體外培養(yǎng)條件下，多種細(xì)胞因子能夠調(diào)節(jié)SSCs增殖，而表皮生長(zhǎng)因子家族(EGF family)是其中重要的一類(lèi)調(diào)控因子。Oatley等[14]發(fā)現(xiàn)，EGF能夠與GDNF共同作用從而調(diào)節(jié)SSCs的增殖，阻遏其分化，從而提高其體外培養(yǎng)過(guò)程中的數(shù)量。而目前仍有較多EGFR配體對(duì)于SSCs的影響尚待研究，因此研究表皮生長(zhǎng)因子家族成員對(duì)SSCs體外培養(yǎng)條件下的影響，能夠?qū)SCs體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化提供理論參考。

Epiregulin作為EGF家族成員可以通過(guò)異源二聚化，激活PIK3-AKT和MEK-MAPK通路，調(diào)節(jié)血管生成、卵母細(xì)胞成熟和血管重塑，具有刺激DNA合成的生物活性，能夠通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖促進(jìn)炎癥、傷口愈合[3]。同時(shí)Epiregulin高表達(dá)于多種癌細(xì)胞中，癌細(xì)胞去甲基化能夠?qū)е缕鋗RNA表達(dá)增加[15]。Wilson等[4]發(fā)現(xiàn)，Epiregulin相比EGF在多種細(xì)胞中對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖和DNA合成的效果更為顯著。本研究結(jié)果顯示，添加20 ng/ml Epiregulin能夠顯著提高山羊SSCs的細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)，并且體外培養(yǎng)9 d后的細(xì)胞活力顯著高于其他組(P<0.05)。相比同為EGF家族的Epigen，Epiregulin促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果更為顯著，這與Wilson等[4]的結(jié)果相符合。Epiregulin作為一種特征性廣泛的特異性EGF樣配體，其對(duì)SSCs增殖更好的促進(jìn)效果可能是因?yàn)槠洳粌H能夠激活ErbB-1和ErbB-4的同型二聚體，還能夠激活所有可能的異二聚體ErbB復(fù)合物所致[4-5]。因此相較于EGF，其可以通過(guò)激活刺激ErbB-2/ErbB-3異二聚體從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和DNA合成。同時(shí)Shelly等[5]研究發(fā)現(xiàn)Epiregulin對(duì)MAPK的總活性提高較低，但比EGF的持續(xù)效果更長(zhǎng)，而EGFR配體會(huì)差異性的影響EGFR降解，這表明Epiregulin可能是通過(guò)加速受體的退化和受體回收抑制等機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞增殖[4-6]。

在本試驗(yàn)中添加100 ng/mL Epigen 能夠顯著增加培養(yǎng)中SSCs的數(shù)量(P<0.05)，而20 ng/mL Epigen對(duì)于促進(jìn)SSCs增殖的效果并不顯著(P>0.05)。先前的研究表明小鼠SSCs培養(yǎng)基中EGF的添加量宜為20 ng/mL[14]，顯著低于本實(shí)驗(yàn)中Epigen的有效濃度。Epigen能夠刺激c-erbB-1和MAP的磷酸化從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[8]，Shiraishi[16]的研究表明，Epigen對(duì)EGF受體及ErbB1的親和度低于EGF，促進(jìn)人永生化表皮細(xì)胞增殖的添加量較TGFα高10倍，本試驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)與之相符。Epigen的研究相對(duì)較少，目前認(rèn)為造成這種差異的原因主要可能是因?yàn)椴煌珽GFR對(duì)不同配體的特異性，以及不同配體影響EGFR內(nèi)化，再循環(huán)和降解途徑不同所導(dǎo)致[4,14]。

受體酪氨酸激酶c-Kit能夠調(diào)控造血，黑素生成和配子發(fā)生[17]。對(duì)于睪丸組織，c-Kit能夠調(diào)節(jié)雄性生殖細(xì)胞之前的原始生殖細(xì)胞遷移與分化，而SCF其能夠與c-Kit結(jié)合從而激活下游信號(hào)通路對(duì)生殖細(xì)胞的生理活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[12]。Feng等[18]的研究表明添加SCF能夠促進(jìn)SSCs的增殖和分化。尹明[19]發(fā)現(xiàn)在含血清的培養(yǎng)條件下添加40 ng/mL SCF能夠促進(jìn)小鼠SSCs的增殖，同時(shí)SCF能夠和bFGF形成協(xié)同作用促進(jìn)小鼠SSCs的增殖。但是Kubota等[20]的研究表明，在無(wú)血清條件下單獨(dú)添加SCF只能夠略微提高小鼠SSCs在體外培養(yǎng)過(guò)程中的數(shù)量，同時(shí)并未檢測(cè)到c-kit受體的表達(dá)上升。本試驗(yàn)結(jié)果中SSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)添加20 ng/mL SCF能夠提高SSCs的增殖活性與細(xì)胞活力，這可能歸功于SCF能夠與GDNF、bFGF或血清中組分協(xié)同促進(jìn)SSCs的增殖[18]，這與Feng等[26]以及尹明等[27]的研究結(jié)果相吻合。但是SCF的促增殖效果低于添加100 ng/mL Epiregulin和100 ng/mL Epigen，這可能因?yàn)镾CF在促進(jìn)SSCs增殖的同時(shí)，能夠誘導(dǎo)SSCs的分化為次級(jí)精母細(xì)胞，從而影響到了SSCs的增殖[19]。雖然Epiregulin、Epigen和SCF均能夠促進(jìn)山羊SSCs的增殖，但其對(duì)于SSCs調(diào)控的具體機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，精原干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加100 ng/mL Epigen、20 ng/mL的Epiregulin和20 ng/mL的SCF能夠顯著提高山羊精原干細(xì)胞的增殖和細(xì)胞活力，但是添加SCF效果顯著低于Epigen和Epiregulin組。