曲梅 田祎 黃瑛 劉白薇 張新 呂冰 賈蕾 王全意

副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus, VP)是沿海地區(qū)引起食物中毒和夏秋季腹瀉的首要病原菌。副溶血弧菌血清型復(fù)雜多樣。 目前,已知13 個O 抗原和79 個K 抗原[1],有71 種血清型可引起急性胃腸炎。 北京市雖為內(nèi)陸城市,但近年來,由于飲食習(xí)慣和物流的發(fā)展,副溶血性血弧菌引起的腹瀉也呈上升趨勢。 由于抗生素的不規(guī)范使用和選擇壓力,細(xì)菌耐藥問題也日益嚴(yán)重,許多副溶血性弧菌臨床分離菌株出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象[2,3]。 北京市自2010 年以來,在全市二級以上醫(yī)院腸道門診開展腹瀉病原學(xué)監(jiān)測,為了解北京市副溶血性弧菌血清型變遷和流行特征,現(xiàn)將該市2010-2019 年副溶血性弧菌臨床分離株進(jìn)行血清型和耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2010 年4 月-2019 年12 月,以北京市16 個轄區(qū)為監(jiān)測點(diǎn),每區(qū)每周采集10 份感染性腹瀉病人新鮮糞便樣本,全年每區(qū)最低監(jiān)測量330 份,截止到2019 年12 月份,全市共收集46 249 份樣本。所有樣本進(jìn)行副溶血性弧菌的分離、培養(yǎng)和鑒定。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng)和生化鑒定: 分離培養(yǎng)參照《感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS271-2007 )附錄B.3 進(jìn)行。 樣本接種于10 mL 含3% NaCl 的堿性胨水中,37 ℃增菌培養(yǎng)6 h。 增菌液劃線接種于科瑪嘉弧菌顯色瓊脂平板,置37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h。 挑取可疑菌落,采用VITEK2-Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)(法國梅里埃公司)進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。

1.2.2 血清分型: 采用診斷血清(日本生研公司)進(jìn)行分型。 取一定量細(xì)菌于3%NaCl 鹽水中,121 ℃,處理30 min,離心10 min(4 000 r/min),棄上清。 取菌體,做O 抗原血清凝集試驗(yàn)。 K 抗原鑒定:直接取濃菌懸液與多價抗K 血清按適當(dāng)比例混合,出現(xiàn)凝集反應(yīng)時再用單個抗血清進(jìn)行檢測。 用生理鹽水做對照。

1.2.3 藥敏試驗(yàn): (1)2010-2011 年菌株藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer,kB)進(jìn)行,藥敏紙片及MH 培養(yǎng)基均為OXIOD 公司產(chǎn)品。 11 種藥物及抑菌環(huán)直徑(mm)判定標(biāo)準(zhǔn):環(huán)丙沙星(CIP):耐藥(R)≤15,敏感(S)≥21 mm;氨芐西林(AMP):R≤13,S≥17;氯霉素(CHL):R≤12,S≥18;磺胺異噁唑(SUL):R≤10,S≥16;萘啶酸(NAL):R≤13,S≥19;頭孢唑林(CFZ):R≤14,S≥18;頭孢噻肟(CTX):R≤14,S≥23;阿莫西林-克拉維甲酸(AUG):R≤13,S≥18;四環(huán)素(TET):R≤11,S≥15;亞胺培南(IMP):R≤13,S≥16;慶大霉 素(GEN):R ≤12,S ≥15。 (2)2012-2013 年菌株藥敏試驗(yàn)采用梅里埃VITEK2-Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)GN-13 藥敏卡進(jìn)行機(jī)器自動判讀,增加了臨床常用藥:復(fù)方磺胺甲噁唑(SXT)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、頭孢他定(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、氨曲南(AZM)、阿米卡星(AMI)、左氧氟沙星(LEV);減少了阿莫西林-克拉維甲酸(AUG)、氯霉素(CHL)、磺胺異噁唑(SUL)、四環(huán)素(TET)等藥物。(3)2014-2019 年菌株藥敏試驗(yàn)采用最小抑菌濃度(minimal inhibition concentration,MIC)法,使用革蘭氏陰性需氧菌藥敏檢測板(上海星佰生物技術(shù)有限公司)。 2014-2015 年使用的是單塊板包括16 種藥物,2016-2019 年使用的兩塊板包括28 種藥物。 增加了鏈霉素(STR)、頭孢西丁(FOX)、頭孢曲松(CRO)、多西霉素(DOX)、阿奇霉素(AZI)、吉米沙星(GMI)、卡那霉素(KAN)、米諾環(huán)素(MIN)、多黏菌素E(CT)、多黏菌素 B (PB) 等。 藥敏試驗(yàn)均以大腸埃希菌(ATCC25922)做為質(zhì)控菌株。 對三種及以上抗生素耐藥,既為多重耐藥(multidrug resistance,MDR)。 由于試驗(yàn)方法的更新,藥物種類也在不斷調(diào)整,但所有研究結(jié)果都是以美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(clinical and laboratory standards institute,CLSI)2017 年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較判讀,各試驗(yàn)方法間和不同年代數(shù)據(jù)結(jié)果都具有可比性,按每兩年進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)。 (4)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)判定標(biāo)準(zhǔn):在初篩實(shí)驗(yàn)(MIC 法)中頭孢他啶或頭孢噻肟MIC≥2 μg/mL;在ESBL 表型確證試驗(yàn)(MIC 法)中,對兩組中任何一個藥物,在加克拉維酸后MIC 值與不加克拉維酸的MIC 相比,降低值≤3 個倍比稀釋濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 軟件和WPS 2016專用版對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 計(jì)數(shù)資料以率表示,耐藥率比較采用χ2檢驗(yàn)。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉患者副溶血性弧菌分離情況 2010 年4 月-2019 年12 月收集腸道門診腹瀉患者糞便樣本46 249件,共檢出副溶血性弧菌1 853 株,檢出率為4.0%(表1)。 其中20 ～39 歲青壯年組副溶血性弧菌檢出率顯著高于其他年齡組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。 副溶血性弧菌感染患者的男女性別比為1.2 ∶1(1 002/851)。

表1 2010-2019 年北京市腹瀉患者不同年齡組副溶血性弧菌分離率、性別及主要血清型分布

表2 2010-2019 年北京市副溶血性弧菌血清型分布

續(xù)表2

表3 2010-2019 年北京市副溶血性弧菌的藥敏結(jié)果

續(xù)表3

2.2 副溶血性弧菌血清分型 對1853 株副溶血性弧菌進(jìn)行血清學(xué)分型,共檢測出9 個O 群,30 個K 抗原,鑒定出59 種血清型(表2)。 K 抗原缺失即KUT菌株較為常見,除了O6 群外,見于各O 群菌株。 O3 ∶K6型為優(yōu)勢血清型1 254 株,占67.7%;O4 ∶KUT 型164 株,占8.9%;O4 ∶K8型113 株,占6.1%,位居血清型的第3 位。 前4 ～10 位血清型依次是O1 ∶KUT、O2 ∶K3、O4 ∶K9、O3 ∶KUT、O10 ∶K60、O1 ∶K36 和O4 ∶K6。其余血清型菌株數(shù)均不超過10 株。

不同年份血清型構(gòu)成和分布隨著年代的更迭會發(fā)生變遷。 2010 年位居第二位的血清型為O4 ∶K9,2011-2012 年則主要是O4 ∶K8,而近些年又逐步被O4 ∶KUT 所趕超。有很多新的血清型出現(xiàn):如O10 ∶K60自2013 年首次出現(xiàn),連續(xù)幾年持續(xù)存在;罕見血清型O1 ∶K1,O3 ∶K30 為2019 年 新 出 現(xiàn) 血 清 型;另 外 每 年都會出現(xiàn)1 ～5 種僅檢出1 株的一過性血清型。

2.3 耐藥表型特征芐西林的耐藥率雖然較其他藥物處于較高水平,但呈現(xiàn)波動式下降:從2010-2011 年的96.8%到2014-2015 年的24.5%到2018-2019 年的17.1%,隨之相對應(yīng)的是敏感率有上升的趨勢(表3)。 鏈霉素、阿莫西林-克拉維酸和磺胺異噁唑三種藥的耐藥率在2014-2015 年出現(xiàn)了異常的升高,分別為46.5%、30.2%和22.0%,之后有一個下降,隨后趨于平穩(wěn)上升。 其他各類藥物雖然會出現(xiàn)不同年間的波動,但伴隨著敏感率的逐漸降低,耐藥率總體呈現(xiàn)逐漸增高趨勢。

2.3.3 多重耐藥及ESBLs: 對于耐三種以上抗生素的多重耐藥菌株,隨著年代的增加,檢測的抗生素種類增多,也呈上升趨勢,從2010 年的三重耐藥菌株9株(3.6%);到2014 年出現(xiàn)耐3 種以上抗生素達(dá)到32株(20.1%);甚至2018 年以后出現(xiàn)最多抗16 種抗生素的多耐藥菌株,各抗生素排列組合后有幾十種模式。 另外,2016 年以后出現(xiàn)了產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌株5 株。

2.3.1 藥敏概況: 對1 428 株副溶血性弧菌進(jìn)行耐藥性檢測,總體情況:對氨芐西林和多黏菌素E 耐藥率最高,分別為51.5%和47.8%,敏感率分別為33.2%和52.2%(表3)。 其次對頭孢唑林和鏈霉素的耐藥率為22.9%和10.5%。 對頭孢西丁、頭孢噻肟和頭孢吡肟等二、三、四代頭孢會出現(xiàn)個別菌株的耐藥,但敏感率均達(dá)到99%以上。 對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和美洛培南無耐藥。 對其他各類抗生素的代表性藥,均有少量菌株耐藥。

2.3.2 耐藥率隨時間變化: 2010-2019 年菌株對氨

3 討論

血清型構(gòu)成變化能反映種群的變遷,進(jìn)而在一定程度上反映傳染源的變異。 既往研究缺少對北京市年度跨越大,系統(tǒng)全面的副溶血性弧菌血清型報(bào)道。本研究提供了北京市從2010-2019 年較為年完整的人源副溶血性弧菌血清型分布譜。 位于前7 位血清型分別為O3 ∶K6、O4 ∶KUT、O4 ∶K8、O1 ∶KUT、O2 ∶K3、O4 ∶K9和O3 ∶KUT,除O3 ∶K6外,與上海市、溫州市和我國東南地區(qū)人源菌株優(yōu)勢血清構(gòu)成還是有差異的[4],上海 以O(shè)3 ∶K6、O4 ∶K8、O1 ∶K25、O4 ∶K68、O4 ∶K9、O1 ∶K36 和O3 ∶K29 為主[5],溫州則以O(shè)3 ∶K6、O1 ∶K1和O4 ∶K1為主[6],與食源性菌株血清型差異性更大。前3 位優(yōu)勢血清型中,均以20 ～39 歲年齡組所占比例最高。 這與青壯年做為社會主要生產(chǎn)力,外出就餐機(jī)會多、接觸病原體機(jī)會多有關(guān)[7,8]。 因此,應(yīng)加強(qiáng)重點(diǎn)人群的監(jiān)測,加強(qiáng)食品安全和公共衛(wèi)生監(jiān)管。

O3 ∶K6 血清型自1996 年被指定為大流行株,其他血清型 如O4 ∶K68、O1 ∶K25、O1 ∶KUT 和O6 ∶K18等,被認(rèn)為是從O3 ∶K6大流行株演變而來并在亞洲和歐美等國家蔓延[9,10]。 本研究也在不同年份檢出這些血清型,說明這些流行血清型在北京也有散在傳播,造成人群感染。 另外,O4 ∶KUT 血清型近年呈明顯上升趨勢,國內(nèi)有些地區(qū)已超過O3 ∶K6成為優(yōu)勢血清型[11]。 O10 ∶K60 做 為 一 種 新 的 血 清 型,2013 年 首 次從日本的急性胃腸炎患者中分離得到,它的毒力基因、分子特征與大流行菌株高度一致[12],而本研究O10 ∶K60 菌株也分離自2013 年,之后每年都在人群中有散發(fā),這種血清型的來源和傳播鏈還有待于從分子水平通過系統(tǒng)的基因組溯源研究來闡明。

通過本研究為期十年的耐藥監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌耐藥性有上升趨勢。 對氨芐西林和多黏菌素E耐藥最嚴(yán)重,氨芐西林與多數(shù)研究結(jié)果一致[3,13],多黏菌素E 則未見報(bào)道。 對氨基糖苷類的鏈霉素存在一定程度的耐藥,卡那霉素則無耐藥,但其他文獻(xiàn)報(bào)道,水產(chǎn)品中分離到的副溶血性弧菌對卡那霉素和鏈霉素耐藥率都很高[13]。 本研究顯示對環(huán)丙沙星的敏感率高達(dá)99%以上,與其他地區(qū)報(bào)道的低敏感率、高耐藥率不同[13]。 2009-2013 年,我國東南沿海地區(qū)腹瀉患者分離株耐藥率普遍高,氨芐西林的耐藥率最高為87.1%,其次是頭孢西丁(56.9%) 和頭孢唑林(43.7%)且多重耐藥率高達(dá)28%[4],高于本次調(diào)查結(jié)果,亦明顯高于2007-2009 年來自四川、遼寧、浙江、廣西等地腹瀉患者分離的副溶血弧菌耐藥率[14]。 與血清型分布一樣,不同的研究結(jié)果存在異質(zhì)性,除受菌株分離年代、不同來源背景及采取控制干預(yù)措施后會引起血清型和耐藥率的波動性變化等因素的影響,也說明在不同地區(qū)感染性腹瀉患者中,副溶血性弧菌型別和對抗生素的敏感程度有地域差異。 另外副溶血性弧菌人源分離株中有ESBLs 菌株,暗示質(zhì)粒等可移動遺傳元件介導(dǎo)的耐藥基因的傳播及擴(kuò)散,尤其是對氨芐西林抗性的影響,加速了多重耐藥菌株的出現(xiàn)。 對腹瀉患者采用抗生素藥物治療時,要充分考慮其不同區(qū)域之間存在的差異,結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果,確保臨床合理用藥,以降低耐藥菌株的產(chǎn)生。