萬 萍，易曉成，李春霞

(1.成都大學 食品與生物工程學院，四川 成都 610106；2.四川工商職業(yè)技術學院 酒類與食品工程系，四川 都江堰 611830；3.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000)

0 引 言

苦蕎學名韃靼蕎麥，不僅富含其他糧食作物中幾乎沒有的蘆丁及硒元素，同時還含有18種氨基酸、9種脂肪酸、豐富的膳食纖維、葉綠素、粗蛋白、碳水化合物、礦物質及微量元素，含量合理，且不含糖和膽固醇，僅在中國高寒山區(qū)少量種植，是名副其實的無污染天然食品[1-3].同時，還富含生物類黃酮、多肽、糖醇和D-手性肌醇等高活性功能成分，使其具有獨特的保健與生理功能及降“三高”的獨特功效[3].目前，苦蕎加工產品較為單一，一般是將苦蕎麥加工成可直接食用的某類食品，如蕎麥面、苦蕎餅干或蕎麥米飯等，在市場上均受到了廣大消費者的青睞.

由于釀酒在中國有著悠久的歷史，苦蕎含有豐富的淀粉和蛋白質，這為苦蕎釀造酒的生產奠定了良好的基礎.目前利用苦蕎進行酒類生產的產品主要是苦蕎蒸餾酒，而采用苦蕎麥通過傳統(tǒng)生產工藝進行低度釀造酒的生產尚鮮見報道.本研究以苦蕎為原料，借鑒傳統(tǒng)淋飯法黃酒的釀造工藝并與現(xiàn)代生物技術相結合，釀制一種新型低酒精度苦蕎釀造酒，為苦蕎釀造酒產品的開拓及規(guī)?；a提供了有價值的參考.

1 材料與方法

1.1 材 料

釀酒高活性干酵母(安琪酵母有限公司)；80 000 u/g固態(tài)中溫糖化酶(無錫酶制劑廠)；脫皮苦蕎(市售).

1.2 儀器與設備

電子天平(LD型，沈陽龍騰電子有限公司)；分析天平(BS110S，北京賽多利斯天平有限公司)；電熱恒溫干燥箱(DHG-9141，上海宏精實驗設備有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9270，上海齊欣科技有限公司)；分光光度計(WFJ7200，農林珂上海儀器有限公司)；pH計(方舟科技)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市金城國勝實驗儀器廠)；手提式不銹鋼蒸汽消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 工藝路線

生產工藝流程[4]如圖1所示．

1.3.2 操作要點[5]

選用優(yōu)質苦蕎米，用35 ℃水浸泡24 h,浸泡時應注意適時均勻攪動，以手捏即碎，不出現(xiàn)浸爛或白心(硬心)為宜；將浸泡好的苦蕎于蒸鍋內，大火蒸至“熟而不黏，內無生心”，將蒸透后的物料，立即用凈水沖淋，使物料顆粒分離并降溫至55～60 ℃，并瀝去余水，然后置于事先經清洗、滅菌處理的發(fā)酵罐中，加入糖化酶靜置糖化20～30 min；加入28～30 ℃水，再加酵母，混勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵，待主發(fā)酵結束后，進行后酵貯酒，過濾得到成品.

1.3.3 試驗設計

1)單因素試驗設計

選取加水比(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5及6.0 mL·g-1)、酵母添加量(0.09%、0.11%、0.13%、0.15%、0.17%、0.19%、0.21%及0.23%)、發(fā)酵周期(4、5、6、7、8、9、10及11 d)及發(fā)酵溫度(24、26、28、30及32 ℃)等因素分別進行試驗，以酒精度為主要評價指標，探討各單因素對發(fā)酵的影響，并確定最適單因素條件.試驗結果取3組平行樣的平均值.

2)響應曲面法試驗設計

在單因素試驗的基礎上，根據 Design-Expert 8.0.6中心組合試驗設計原則，以加水比、酵母添加量、發(fā)酵周期及發(fā)酵溫度為主要考察因素，以酒精度為響應值，設計了4因素3水平的響應面試驗組.因素與水平編碼見表1.

表1 Box-Behnken試驗因素及編碼

1.3.4 檢測方法

酒精度測定：密度瓶法[6]；總糖含量測定：亞鐵氰化鉀滴定法[7]；總酸含量測定：電位滴定法[7]；淀粉含量測定：酸水解法[8].

(1)

式中,W為苦蕎中總淀粉含量，g/100 g；W0為發(fā)酵醪中淀粉含量，g/100 g.

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 加水比對發(fā)酵醪酒精度的影響

水分在發(fā)酵過程中既能輸送各種營養(yǎng)成分，保證其進行繁殖、分解及合成等生理生化活動，又可作為其代謝產物的有效溶劑.釀酒過程中加入水，可以促進淀粉粒迅速吸收水分，使其糊化，并確保發(fā)酵的正常進行，并且加水量直接影響原料及酶的濃度[9]進而影響發(fā)酵.

糖化酶用量為原料的0.6%，酵母添加量為原料的0.15%，于28 ℃下發(fā)酵7 d，則測定不同加水比發(fā)酵醪酒精度，以確定最適宜的加水比，其結果如圖2所示.

由圖2可知，當加水比在2.5～4 mL·g-1，發(fā)酵醪酒精度隨加水比的增大而升高；當加水比在4～6 mL·g-1，發(fā)酵醪的酒精度隨加水比的增大而降低.加水比在4 mL·g-1時發(fā)酵醪酒精度達到最高，為7.60% vol.加水量太少，醪液濃度高，酶濃度高，不利于糖化和發(fā)酵的進行，而加水比過高，發(fā)酵醪淀粉濃度低，單位體積酶活低，對醪液糖化與發(fā)酵不利，發(fā)酵醪中酒精度低，所以確定最適加水比為4 mL·g-1.

2.1.2 酵母添加量對發(fā)酵醪酒精度的影響

酵母在糖酵解中發(fā)揮著主要作用，所以其添加量影響發(fā)酵的程度[10].糖化酶用量為原料的0.6%，加水比為4 mL·g-1，于28 ℃下發(fā)酵7 d，則測定不同酵母添加量發(fā)酵醪酒精度，以確定最適宜的酵母添加量，其結果如圖3所示.

由圖3可知，當酵母添加量在0.09%～0.15%之間，發(fā)酵醪酒精度隨酵母添加量的增大而升高；當酵母添加量在0.15%～0.23%之間，發(fā)酵醪酒精度隨酵母添加量的增大而降低.酵母添加量在0.15%時發(fā)酵醪酒精度最高，為7.70% vol.酵母添加量不足會影響酒精的生成量，導致發(fā)酵醪酒精度偏低，但酵母添加量過高，在相同的發(fā)酵條件下僅能提高酒精生成的速度，不能增加其含量，反而由于酵母添加量過高，其生長消耗了可發(fā)酵性糖，進而影響了酒精的生成量，所以，確定酵母的最適添加量為原料的0.15%.

2.1.3 發(fā)酵周期對發(fā)酵醪酒精度的影響

發(fā)酵周期影響酵母對發(fā)酵的程度.若發(fā)酵周期延長，不利于微生物的擴大培養(yǎng)和代謝產物的積累；發(fā)酵周期過短又無法完全發(fā)酵，造成原料浪費，進而影響發(fā)酵醪酒精度[10].糖化酶用量為原料的0.6%，加水比為4 mL·g-1，酵母添加量為原料的0.15%，于28 ℃下測定不同發(fā)酵周期發(fā)酵醪酒精度，以確定最適宜的發(fā)酵周期，其結果如圖4所示.

由圖4可知，若發(fā)酵周期在4～7 d之間，發(fā)酵醪酒精度隨發(fā)酵周期的增長而增大；若發(fā)酵周期在7～11 d之間，發(fā)酵醪酒精度隨發(fā)酵周期的增長略有降低.發(fā)酵7 d時發(fā)酵醪酒精度最高，為7.63% vol.發(fā)酵周期生成的酒精量不足，表明發(fā)酵不完全，而發(fā)酵周期過長，酒精度反而略有降低，說明已經生成的酒精有所揮發(fā)或生成其他的物質被消耗掉了.因此，確定最適發(fā)酵周期為7 d.

2.1.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵醪酒精度的影響

發(fā)酵溫度過低影響發(fā)酵的速度及發(fā)酵最終所生成的酒精量，發(fā)酵溫度過高則易造成酸敗等異常發(fā)酵[11].糖化酶用量為原料的0.6%，加水比為4 mL·g-1，酵母添加量為原料的0.15%，發(fā)酵周期為7 d，則測定不同發(fā)酵溫度發(fā)酵醪酒精度，以確定最適宜的發(fā)酵溫度，其結果如圖5所示.

由圖5可知，若發(fā)酵溫度在24～28 ℃之間，發(fā)酵醪酒精度隨發(fā)酵溫度的升高而升高；若發(fā)酵溫度在28～32 ℃之間，發(fā)酵醪酒精度隨發(fā)酵溫度的升高而降低.當發(fā)酵溫度為28 ℃時酒精度最高，達7.65% vol.發(fā)酵溫度過低，發(fā)酵緩慢,在一定的發(fā)酵時間內，生成的酒精量也低，而發(fā)酵溫度過高，對酵母的生長和發(fā)酵菌不利，造成發(fā)酵不徹底且酒精度也低.因此，確定最適發(fā)酵溫度為28 ℃.

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 模型方程的建立與顯著性影響

根據單因素試驗結果，以加水比(A)、發(fā)酵溫度(B)、酵母添加量(C)及發(fā)酵周期(D)為自變量，以酒精度(Y)為響應值，按照 Box-Behnken 試驗設計原理，設計出4因素3水平的29組試驗.試驗結果見表2，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結果見表3.

表2 響應面試驗設計與結果

表3 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結果

2.2.2 響應面試驗結果及分析

用Design-Expert V8.0.6統(tǒng)計軟件對表2中的試驗數(shù)據進行擬合分析，得到多元二次回歸方程模型為：

Y=+7.68-0.068A-0.14B-0.081C+0.054D-0.40AB+0.20AC-0.42AD+0.15BC+0.075BD+0.16CD-0.46A2-1.17B2-0.018C2-0.99D2

(1)

由表3可知，回歸模型達到極顯著水平(P<0.000 1)，失擬項不顯著(P=0.055 5>0.05)，說明該二次多項回歸方程對試驗擬合情況良好，試驗誤差小；該模型(R2=0.991 7)的校正決定系數(shù)(AdjR2=0.983 3)表示實測值與預測值高度相關，回歸模型與實測值能夠很好地進行擬合；變異系數(shù)CV=1.47%，數(shù)值低，表明試驗穩(wěn)定性好，結果可靠.綜上所述，該模型與實際試驗擬合良好，響應值與所有自變量之間的線性關系顯著，可以用于最佳試驗條件的預測.由表3方差分析結果表明，一次項(B)、交互項(AB、AC、AD、BC、CD)、二次項(A2、B2、C2、D2)影響極其顯著(P<0.01)；A、C影響顯著(P<0.05)；D、BD影響不顯著(P>0.05).各因素對酒精度影響的順序為：B>C>A>D,即：發(fā)酵溫度>酵母添加量>加水比>發(fā)酵周期.利用Design-Expert V8.0.6軟件對試驗數(shù)據進行分析，得到響應面圖及等高線圖，能直觀地反映出各因素間交互作用對酒精度的影響，結果如圖6～圖11所示.

由圖6～圖11可知，加水比、發(fā)酵溫度、酵母添加量及發(fā)酵周期4個因素的任意兩兩組合中，當其中1個因素不變時，酒精度都會隨另1個因素的增加而呈現(xiàn)先升后降的趨勢.而任意2個因素的交互作用對酒精度的影響，從等高線可以直觀看出，圖6～圖9、圖11等高線圖橢圓度較大，說明加水比與發(fā)酵溫度、酵母添加量與加水比、發(fā)酵周期與加水比、酵母添加量與發(fā)酵溫度、酵母添加量與發(fā)酵周期的交互作用對酒精度的影響顯著，而圖10等高線圖橢圓度較小，說明發(fā)酵周期與發(fā)酵溫度間的交互作用對酒精度的影響不顯著.

2.3 試驗驗證

通過響應面優(yōu)化軟件自動生成的最優(yōu)條件：加水比A為3.87 mL·g-1，發(fā)酵溫度B為27.89 ℃，添加酵母量C為0.14%，發(fā)酵周期D為7.03 d，預測值為7.70%vol.為驗證模型的可靠性，并考慮試驗的可操作性，在加水比為3.87 mL·g-1、發(fā)酵溫度為27.9 ℃、添加酵母量為0.14%且發(fā)酵周期為7.03 d(169 h)的條件下進行3組試驗，測得其酒精度平均值為7.74%vol，與預測值的誤差為0.52%，2個結果相符.

3 結 論

本研究采用響應面法對淋飯法苦蕎釀造酒發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，得出最佳工藝為：糖化酶用量為原料的0.6%，加水比為3.87 mL·g-1，添加酵母量為0.14%，發(fā)酵溫度為27.9 ℃，發(fā)酵7.03 d(169 h)后，其酒精度最高為7.74% vol(20 ℃)，總酸(以乳酸計)為6.9 g/L，總糖(以葡萄糖計)為4 g/L，淀粉利用率達52.9%.所得產品色香味俱佳，具有青稞干黃酒獨特的風味.

淋飯法會造成原料中部分可溶性組分的流失，因此，下一步將在提高原料利用率及保留產品中具有保健功能組分的含量方面進行更深入的研究.