萬 萍，易曉成，李春霞

(1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 酒類與食品工程系，四川 都江堰 611830；3.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000)

0 引 言

苦蕎學(xué)名韃靼蕎麥，不僅富含其他糧食作物中幾乎沒有的蘆丁及硒元素，同時還含有18種氨基酸、9種脂肪酸、豐富的膳食纖維、葉綠素、粗蛋白、碳水化合物、礦物質(zhì)及微量元素，含量合理，且不含糖和膽固醇，僅在中國高寒山區(qū)少量種植，是名副其實(shí)的無污染天然食品[1-3].同時，還富含生物類黃酮、多肽、糖醇和D-手性肌醇等高活性功能成分，使其具有獨(dú)特的保健與生理功能及降“三高”的獨(dú)特功效[3].目前，苦蕎加工產(chǎn)品較為單一，一般是將苦蕎麥加工成可直接食用的某類食品，如蕎麥面、苦蕎餅干或蕎麥米飯等，在市場上均受到了廣大消費(fèi)者的青睞.

由于釀酒在中國有著悠久的歷史，苦蕎含有豐富的淀粉和蛋白質(zhì)，這為苦蕎釀造酒的生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ).目前利用苦蕎進(jìn)行酒類生產(chǎn)的產(chǎn)品主要是苦蕎蒸餾酒，而采用苦蕎麥通過傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝進(jìn)行低度釀造酒的生產(chǎn)尚鮮見報(bào)道.本研究以苦蕎為原料，借鑒傳統(tǒng)淋飯法黃酒的釀造工藝并與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合，釀制一種新型低酒精度苦蕎釀造酒，為苦蕎釀造酒產(chǎn)品的開拓及規(guī)?；a(chǎn)提供了有價值的參考.

1 材料與方法

1.1 材 料

釀酒高活性干酵母(安琪酵母有限公司)；80 000 u/g固態(tài)中溫糖化酶(無錫酶制劑廠)；脫皮苦蕎(市售).

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(LD型，沈陽龍騰電子有限公司)；分析天平(BS110S，北京賽多利斯天平有限公司)；電熱恒溫干燥箱(DHG-9141，上海宏精實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9270，上海齊欣科技有限公司)；分光光度計(jì)(WFJ7200，農(nóng)林珂上海儀器有限公司)；pH計(jì)(方舟科技)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；手提式不銹鋼蒸汽消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 工藝路線

生產(chǎn)工藝流程[4]如圖1所示．

1.3.2 操作要點(diǎn)[5]

選用優(yōu)質(zhì)苦蕎米，用35 ℃水浸泡24 h,浸泡時應(yīng)注意適時均勻攪動，以手捏即碎，不出現(xiàn)浸爛或白心(硬心)為宜；將浸泡好的苦蕎于蒸鍋內(nèi)，大火蒸至“熟而不黏，內(nèi)無生心”，將蒸透后的物料，立即用凈水沖淋，使物料顆粒分離并降溫至55～60 ℃，并瀝去余水，然后置于事先經(jīng)清洗、滅菌處理的發(fā)酵罐中，加入糖化酶靜置糖化20～30 min；加入28～30 ℃水，再加酵母，混勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，待主發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行后酵貯酒，過濾得到成品.

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取加水比(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5及6.0 mL·g-1)、酵母添加量(0.09%、0.11%、0.13%、0.15%、0.17%、0.19%、0.21%及0.23%)、發(fā)酵周期(4、5、6、7、8、9、10及11 d)及發(fā)酵溫度(24、26、28、30及32 ℃)等因素分別進(jìn)行試驗(yàn)，以酒精度為主要評價指標(biāo)，探討各單因素對發(fā)酵的影響，并確定最適單因素條件.試驗(yàn)結(jié)果取3組平行樣的平均值.

2)響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù) Design-Expert 8.0.6中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，以加水比、酵母添加量、發(fā)酵周期及發(fā)酵溫度為主要考察因素，以酒精度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)組.因素與水平編碼見表1.

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素及編碼

1.3.4 檢測方法

酒精度測定：密度瓶法[6]；總糖含量測定：亞鐵氰化鉀滴定法[7]；總酸含量測定：電位滴定法[7]；淀粉含量測定：酸水解法[8].

(1)

式中,W為苦蕎中總淀粉含量，g/100 g；W0為發(fā)酵醪中淀粉含量，g/100 g.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 加水比對發(fā)酵醪酒精度的影響

水分在發(fā)酵過程中既能輸送各種營養(yǎng)成分，保證其進(jìn)行繁殖、分解及合成等生理生化活動，又可作為其代謝產(chǎn)物的有效溶劑.釀酒過程中加入水，可以促進(jìn)淀粉粒迅速吸收水分，使其糊化，并確保發(fā)酵的正常進(jìn)行，并且加水量直接影響原料及酶的濃度[9]進(jìn)而影響發(fā)酵.

糖化酶用量為原料的0.6%，酵母添加量為原料的0.15%，于28 ℃下發(fā)酵7 d，則測定不同加水比發(fā)酵醪酒精度，以確定最適宜的加水比，其結(jié)果如圖2所示.

由圖2可知，當(dāng)加水比在2.5～4 mL·g-1，發(fā)酵醪酒精度隨加水比的增大而升高；當(dāng)加水比在4～6 mL·g-1，發(fā)酵醪的酒精度隨加水比的增大而降低.加水比在4 mL·g-1時發(fā)酵醪酒精度達(dá)到最高，為7.60% vol.加水量太少，醪液濃度高，酶濃度高，不利于糖化和發(fā)酵的進(jìn)行，而加水比過高，發(fā)酵醪淀粉濃度低，單位體積酶活低，對醪液糖化與發(fā)酵不利，發(fā)酵醪中酒精度低，所以確定最適加水比為4 mL·g-1.

2.1.2 酵母添加量對發(fā)酵醪酒精度的影響

酵母在糖酵解中發(fā)揮著主要作用，所以其添加量影響發(fā)酵的程度[10].糖化酶用量為原料的0.6%，加水比為4 mL·g-1，于28 ℃下發(fā)酵7 d，則測定不同酵母添加量發(fā)酵醪酒精度，以確定最適宜的酵母添加量，其結(jié)果如圖3所示.

由圖3可知，當(dāng)酵母添加量在0.09%～0.15%之間，發(fā)酵醪酒精度隨酵母添加量的增大而升高；當(dāng)酵母添加量在0.15%～0.23%之間，發(fā)酵醪酒精度隨酵母添加量的增大而降低.酵母添加量在0.15%時發(fā)酵醪酒精度最高，為7.70% vol.酵母添加量不足會影響酒精的生成量，導(dǎo)致發(fā)酵醪酒精度偏低，但酵母添加量過高，在相同的發(fā)酵條件下僅能提高酒精生成的速度，不能增加其含量，反而由于酵母添加量過高，其生長消耗了可發(fā)酵性糖，進(jìn)而影響了酒精的生成量，所以，確定酵母的最適添加量為原料的0.15%.

2.1.3 發(fā)酵周期對發(fā)酵醪酒精度的影響

發(fā)酵周期影響酵母對發(fā)酵的程度.若發(fā)酵周期延長，不利于微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的積累；發(fā)酵周期過短又無法完全發(fā)酵，造成原料浪費(fèi)，進(jìn)而影響發(fā)酵醪酒精度[10].糖化酶用量為原料的0.6%，加水比為4 mL·g-1，酵母添加量為原料的0.15%，于28 ℃下測定不同發(fā)酵周期發(fā)酵醪酒精度，以確定最適宜的發(fā)酵周期，其結(jié)果如圖4所示.

由圖4可知，若發(fā)酵周期在4～7 d之間，發(fā)酵醪酒精度隨發(fā)酵周期的增長而增大；若發(fā)酵周期在7～11 d之間，發(fā)酵醪酒精度隨發(fā)酵周期的增長略有降低.發(fā)酵7 d時發(fā)酵醪酒精度最高，為7.63% vol.發(fā)酵周期生成的酒精量不足，表明發(fā)酵不完全，而發(fā)酵周期過長，酒精度反而略有降低，說明已經(jīng)生成的酒精有所揮發(fā)或生成其他的物質(zhì)被消耗掉了.因此，確定最適發(fā)酵周期為7 d.

2.1.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵醪酒精度的影響

發(fā)酵溫度過低影響發(fā)酵的速度及發(fā)酵最終所生成的酒精量，發(fā)酵溫度過高則易造成酸敗等異常發(fā)酵[11].糖化酶用量為原料的0.6%，加水比為4 mL·g-1，酵母添加量為原料的0.15%，發(fā)酵周期為7 d，則測定不同發(fā)酵溫度發(fā)酵醪酒精度，以確定最適宜的發(fā)酵溫度，其結(jié)果如圖5所示.

由圖5可知，若發(fā)酵溫度在24～28 ℃之間，發(fā)酵醪酒精度隨發(fā)酵溫度的升高而升高；若發(fā)酵溫度在28～32 ℃之間，發(fā)酵醪酒精度隨發(fā)酵溫度的升高而降低.當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時酒精度最高，達(dá)7.65% vol.發(fā)酵溫度過低，發(fā)酵緩慢,在一定的發(fā)酵時間內(nèi)，生成的酒精量也低，而發(fā)酵溫度過高，對酵母的生長和發(fā)酵菌不利，造成發(fā)酵不徹底且酒精度也低.因此，確定最適發(fā)酵溫度為28 ℃.

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 模型方程的建立與顯著性影響

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以加水比(A)、發(fā)酵溫度(B)、酵母添加量(C)及發(fā)酵周期(D)為自變量，以酒精度(Y)為響應(yīng)值，按照 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)出4因素3水平的29組試驗(yàn).試驗(yàn)結(jié)果見表2，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

用Design-Expert V8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，得到多元二次回歸方程模型為：

Y=+7.68-0.068A-0.14B-0.081C+0.054D-0.40AB+0.20AC-0.42AD+0.15BC+0.075BD+0.16CD-0.46A2-1.17B2-0.018C2-0.99D2

(1)

由表3可知，回歸模型達(dá)到極顯著水平(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.055 5>0.05)，說明該二次多項(xiàng)回歸方程對試驗(yàn)擬合情況良好，試驗(yàn)誤差??；該模型(R2=0.991 7)的校正決定系數(shù)(AdjR2=0.983 3)表示實(shí)測值與預(yù)測值高度相關(guān)，回歸模型與實(shí)測值能夠很好地進(jìn)行擬合；變異系數(shù)CV=1.47%，數(shù)值低，表明試驗(yàn)穩(wěn)定性好，結(jié)果可靠.綜上所述，該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好，響應(yīng)值與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著，可以用于最佳試驗(yàn)條件的預(yù)測.由表3方差分析結(jié)果表明，一次項(xiàng)(B)、交互項(xiàng)(AB、AC、AD、BC、CD)、二次項(xiàng)(A2、B2、C2、D2)影響極其顯著(P<0.01)；A、C影響顯著(P<0.05)；D、BD影響不顯著(P>0.05).各因素對酒精度影響的順序?yàn)椋築>C>A>D,即：發(fā)酵溫度>酵母添加量>加水比>發(fā)酵周期.利用Design-Expert V8.0.6軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到響應(yīng)面圖及等高線圖，能直觀地反映出各因素間交互作用對酒精度的影響，結(jié)果如圖6～圖11所示.

由圖6～圖11可知，加水比、發(fā)酵溫度、酵母添加量及發(fā)酵周期4個因素的任意兩兩組合中，當(dāng)其中1個因素不變時，酒精度都會隨另1個因素的增加而呈現(xiàn)先升后降的趨勢.而任意2個因素的交互作用對酒精度的影響，從等高線可以直觀看出，圖6～圖9、圖11等高線圖橢圓度較大，說明加水比與發(fā)酵溫度、酵母添加量與加水比、發(fā)酵周期與加水比、酵母添加量與發(fā)酵溫度、酵母添加量與發(fā)酵周期的交互作用對酒精度的影響顯著，而圖10等高線圖橢圓度較小，說明發(fā)酵周期與發(fā)酵溫度間的交互作用對酒精度的影響不顯著.

2.3 試驗(yàn)驗(yàn)證

通過響應(yīng)面優(yōu)化軟件自動生成的最優(yōu)條件：加水比A為3.87 mL·g-1，發(fā)酵溫度B為27.89 ℃，添加酵母量C為0.14%，發(fā)酵周期D為7.03 d，預(yù)測值為7.70%vol.為驗(yàn)證模型的可靠性，并考慮試驗(yàn)的可操作性，在加水比為3.87 mL·g-1、發(fā)酵溫度為27.9 ℃、添加酵母量為0.14%且發(fā)酵周期為7.03 d(169 h)的條件下進(jìn)行3組試驗(yàn)，測得其酒精度平均值為7.74%vol，與預(yù)測值的誤差為0.52%，2個結(jié)果相符.

3 結(jié) 論

本研究采用響應(yīng)面法對淋飯法苦蕎釀造酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳工藝為：糖化酶用量為原料的0.6%，加水比為3.87 mL·g-1，添加酵母量為0.14%，發(fā)酵溫度為27.9 ℃，發(fā)酵7.03 d(169 h)后，其酒精度最高為7.74% vol(20 ℃)，總酸(以乳酸計(jì))為6.9 g/L，總糖(以葡萄糖計(jì))為4 g/L，淀粉利用率達(dá)52.9%.所得產(chǎn)品色香味俱佳，具有青稞干黃酒獨(dú)特的風(fēng)味.

淋飯法會造成原料中部分可溶性組分的流失，因此，下一步將在提高原料利用率及保留產(chǎn)品中具有保健功能組分的含量方面進(jìn)行更深入的研究.