何家林，周楊楊，程 強(qiáng)，羿國(guó)娟，陳 勇，魯 蘭

(成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052)

0 引 言

隨著抗生素的濫用，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重.銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)是外傷感染最常見(jiàn)致病菌，毒力強(qiáng)并易產(chǎn)生耐藥性[1-2].細(xì)菌通過(guò)運(yùn)動(dòng)黏附在體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生定植，進(jìn)而發(fā)生感染，和致病性息息相關(guān)，而細(xì)菌生物被膜的產(chǎn)生，可以阻止抗生素的進(jìn)入，使產(chǎn)生生物被膜的菌株比浮游菌的耐藥性提高100～1 000倍，是產(chǎn)生耐藥性的重要途徑，也是導(dǎo)致院內(nèi)長(zhǎng)期和反復(fù)感染的重要原因之一[3-8].目前，中藥及天然產(chǎn)物在抗菌藥物的研發(fā)領(lǐng)域越來(lái)越受到關(guān)注，成為發(fā)現(xiàn)新型抗菌藥物的重要方向[9-10].然而，具有抗菌作用的中藥在體內(nèi)由于其吸收、分布和代謝過(guò)程，往往難以達(dá)到其直接抗菌的有效濃度，多數(shù)以亞抑菌濃度(Sub-Minimum inhibitory concentration，Sub-MIC)發(fā)揮其作用.Sub-MIC抗菌藥物雖不能直接抑制細(xì)菌，但可影響細(xì)菌耐藥、黏附與運(yùn)動(dòng)等生物學(xué)效應(yīng).四季青為冬青科植物冬青的干燥葉，性涼、味苦且微澀，功效為清熱解毒、生肌斂瘡及活血止血，臨床上常以單味藥材水煎液外用，治療燒燙傷效果特佳[11-12].本研究以臨床收集的常見(jiàn)致病菌株為對(duì)象，對(duì)四季青水煎液的抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)Sub-MIC四季青水煎液抑制銅綠假單胞菌運(yùn)動(dòng)和生物被膜形成的能力及消除生物被膜的量-效關(guān)系進(jìn)行探討，為四季青臨床抗感染治療提供了理論基礎(chǔ)和參考.

1 材料與儀器

1.1 材 料

四季青葉(冬青科植物冬青Ilex chinensis Sims的干燥葉，經(jīng)四川抗菌素工業(yè)研究所抗生素藥效評(píng)價(jià)中心按中國(guó)藥典2015版一部鑒別，經(jīng)測(cè)定含原兒茶酸0.176%、綠原酸0.056%及槲皮素0.008%，對(duì)實(shí)驗(yàn)銅綠假單胞菌最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)為100 mg/mL)，購(gòu)自廣西亳州市君源堂藥材站；臨床分離致病菌株：金黃色葡萄球菌(MSSA)5株、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)5株、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌(KE+)5株、大腸桿菌(KE-)5株、銅綠假單胞菌(Pa)5株，均由四川抗菌素工業(yè)研究所提供；質(zhì)控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸桿菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853，購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(American type culture collection,ATCC)；MH(A)培養(yǎng)基(批號(hào)，20180602)，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胰酪大豆瓊脂培養(yǎng)基TSA(批號(hào)，7053894)，購(gòu)自美國(guó)BD公司；胰蛋白胨(批號(hào)，201901-002)，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母浸出粉，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；瓊脂粉(批號(hào)，180201)，購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯NB(批號(hào)，201902-013)，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；美羅培南(批號(hào)，181003)，購(gòu)自?？谑兄扑帍S有限公司；二甲基亞砜DMSO(批號(hào)，20130701)，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；氯化鈉(批號(hào)，2019022101)，購(gòu)自成都科隆化學(xué)品有限公司；生理鹽水(批號(hào)，M0040806C)，購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；25%戊二醛(批號(hào)，20181101)，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；結(jié)晶紫(批號(hào)，602w041)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇(批號(hào)，2018051301)，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；無(wú)菌96孔板(批號(hào)，010617A005，規(guī)格，12×8孔)，購(gòu)自NEST公司；麥?zhǔn)媳葷峁?批號(hào)，075870)，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司.

1.2 儀 器

Multiskan FC型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)，ZHWY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)，GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Sartorius BS124S型電子天平(德國(guó)Sartorius公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液與平板制備

2.1.1 四季青水煎液制備

稱取干燥四季青葉30 g，用潔凈紗布包好置于砂鍋內(nèi)，加蒸餾水500 mL，浸泡30 min，武火100 ℃煎煮15 min，轉(zhuǎn)文火100 ℃繼續(xù)煎煮30 min，倒出藥液(約50 mL)，再加500 mL蒸餾水.按上述方法煎制，將2次藥液(約100 mL)合并后100 ℃濃縮30 min至10 mL，其濃度相當(dāng)于生藥量3 000 mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用.

2.1.2 培養(yǎng)平板與培養(yǎng)液制備

TSA平板：稱取TSA培養(yǎng)基4 g，加蒸餾水100 mL,使其溶解后，121 ℃高壓滅菌30 min，備用.

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨4 g，酵母浸出粉2 g，氯化鈉4 g，加蒸餾水400 mL，調(diào)pH值至7.0，121 ℃高壓滅菌30 min，備用.

浮泳運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基：稱胰蛋白胨3 g，氯化鈉3 g，瓊脂1.5 g，加300 mL蒸餾水，攪勻，121 ℃高壓滅菌30 min，50 ℃水浴保溫備用.

蹭行運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基：稱胰蛋白胨3 g，酵母浸出粉1.5 g，氯化鈉3 g，瓊脂3 g，加300 mL蒸餾水，攪勻，121 ℃高壓滅菌30 min，50 ℃水浴保溫備用.

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：稱取營(yíng)養(yǎng)肉湯NB培養(yǎng)基1.8 g，加蒸餾水100 mL，121 ℃高壓滅菌30 min，備用.

2.2 四季青水煎液的體外抗菌活性

采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)瓊脂二倍稀釋法進(jìn)行MIC測(cè)定.取3 000 mg/mL四季青水煎液，按二倍稀釋法使其在3 000～46.87 mg/mL范圍內(nèi).實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置美羅培南陽(yáng)性對(duì)照組和菌液對(duì)照組進(jìn)行質(zhì)控.

無(wú)菌平皿內(nèi)分別加入不同濃度四季青水煎液各1 mL，再加入融化的50 ℃ MH(A)培養(yǎng)基14 mL，混勻，按二倍稀釋法使每平皿內(nèi)所含藥物濃度依次為200、100、50.0、25.0、12.5、6.25、3.12 mg/mL，待冷卻后用多點(diǎn)接種儀分別接種不同菌液，菌液濃度為106CFU/mL，于35 ℃ 培養(yǎng)18～20 h，平皿內(nèi)未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度(即最低抑菌濃度MIC).結(jié)果表明，四季青葉水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌MSSA和MRSA的抗菌活性最強(qiáng)，均為6.25 mg/mL，而對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性相對(duì)較弱，如表1所示.由此可見(jiàn)，四季青抗銅綠假單胞菌的MIC值較大，由于藥物的吸收代謝等過(guò)程，在體內(nèi)難以達(dá)到MIC值，基本是以Sub-MIC存在，所以難以發(fā)揮直接的抗菌作用.因此，有必要研究其Sub-MIC對(duì)銅綠假單胞菌其他方面的影響.

表1 四季青水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的MICR(n=5)

2.3 Sub-MIC四季青水煎液對(duì)銅綠假單胞菌運(yùn)動(dòng)能力的影響

2.3.1 浮泳運(yùn)動(dòng)

取銅綠假單胞菌于TSA平板上復(fù)蘇過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落溶于無(wú)菌生理鹽水，調(diào)至5.0麥?zhǔn)媳葷岫龋肔B培養(yǎng)基稀釋10倍后于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)20 h，備用.用浮泳運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基和四季青水煎液混合，按二倍稀釋法分別制成含藥量為100、50.0、25.0、12.5、6.25 mg/mL(相當(dāng)于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC)的浮泳運(yùn)動(dòng)平板，同時(shí)制備空白對(duì)照.取上述靜置培養(yǎng)20 h后的銅綠假單胞菌培養(yǎng)液1 μL接種于培養(yǎng)基的表面，37 ℃正置培養(yǎng)18 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)定其生長(zhǎng)直徑.

四季青水煎液對(duì)銅綠假單胞菌浮泳運(yùn)動(dòng)的抑制能力如表2與圖1所示.在四季青水煎液濃度為50 mg/mL和25 mg/mL(1/2×MIC和1/4×MIC)時(shí)，其菌落生長(zhǎng)直徑與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)，對(duì)細(xì)菌浮泳運(yùn)動(dòng)有較好的抑制作用.

表2 Sub-MIC四季青水煎液對(duì)銅綠假單胞菌浮泳運(yùn)動(dòng)的影響(n=6)

2.3.2 蹭行運(yùn)動(dòng)

取銅綠假單胞菌于TSA平板上復(fù)蘇過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落溶于無(wú)菌生理鹽水，調(diào)至5.0麥?zhǔn)媳葷岫?，用LB培養(yǎng)基稀釋10倍后于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)20 h，備用.用蹭行運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基和四季青水煎液混合，按二倍稀釋法分別制成含藥量為100、50.0、25.0、12.5、6.25 mg/mL(相當(dāng)于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC)的蹭行運(yùn)動(dòng)平板，同時(shí)制備空白對(duì)照.取上述靜置培養(yǎng)20 h后的銅綠假單胞菌培養(yǎng)液1 μL接種于培養(yǎng)基底部與培養(yǎng)皿接觸的地方，37 ℃正置培養(yǎng)18 h，游標(biāo)卡尺測(cè)定其生長(zhǎng)直徑.

四季青水煎液對(duì)銅綠假單胞菌蹭行運(yùn)動(dòng)的抑制能力如表3與圖2所示.在四季青水煎液濃度為50 mg/mL和25 mg/mL(1/2×MIC和1/4×MIC)時(shí)，其菌落生長(zhǎng)直徑與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)，對(duì)細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)有較好的抑制作用.

表3 Sub-MIC四季青水煎液對(duì)銅綠假單胞菌蹭行運(yùn)動(dòng)的影響(n=6)

2.4 Sub-MIC四季青水煎液對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的作用

取銅綠假單胞菌于TSA平板上復(fù)蘇過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落溶于無(wú)菌生理鹽水，調(diào)至1.0麥?zhǔn)媳葷岫龋脿I(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋20倍后備用.

取1套96孔板，于第2～10列，每列第2行起6個(gè)復(fù)孔中，分別加入備用的菌液200 μL，置37 ℃恒溫培養(yǎng)3 d 后取出，倒掉剩余培養(yǎng)液，用無(wú)菌生理鹽水小心洗滌2次；于第2～9列中分別加入四季青水煎液濃度為100、50.0、25.0、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 mg/mL(分別相當(dāng)于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC、1/32×MIC、1/64×MIC、1/128×MIC)的營(yíng)養(yǎng)肉湯液200 μL；第10列為不含四季青水煎液的空白對(duì)照，每列6個(gè)復(fù)孔，其余孔中分別加入無(wú)菌生理鹽水200 μL，置37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后取出，用無(wú)菌生理鹽水小心洗滌2次，加入2.5%戊二醛280 μL后固定20 min，用生理鹽水洗滌2次，加入2%結(jié)晶紫溶液280 μL染色10 min，再用無(wú)菌生理鹽水緩慢洗去多余結(jié)晶紫，加入200 μL無(wú)水乙醇溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處OD值.

四季青水煎液對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜72 h的消除作用如表4與圖3所示.四季青水煎液在濃度為100、50.0、25.0、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 mg/mL(分別相當(dāng)于1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC、1/32×MIC、1/64×MIC、1/128×MIC)時(shí)，與空白對(duì)照組比較，在100～6.25 mg/mL(1～1/16MIC)濃度范圍，各組均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01).

2.5 Sub-MIC四季青水煎液消除銅綠假單胞菌生物被膜作用的量-效關(guān)系

根據(jù)四季青水煎液對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜消除的有效劑量(1×MIC～1/16×MIC)和消除率，采用PKSolver 2.0軟件SigmodEmaxPD模型，分別用2種基本S曲線模型對(duì)有效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，獲得相關(guān)參數(shù)為：SigmoidEmaxModel(模型1)AIC值為33.84，R2值為0.97；SigmoidEmaxModel withE0(模型2)AIC值為31.12，R2值為0.99.根據(jù)擬合優(yōu)度，選擇SigmoidEmaxModel withE0(模型2)進(jìn)行擬合，結(jié)果如表5、表6和圖4所示.其中，Emax為52.20%，EC50為7.02 mg/mL，E0為12.69%，擬合式為，

(1)

表5 Sub-MIC四季青水煎液對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜消除率

表6 Sub-MIC四季青水煎液消除生物被膜作用的PD參數(shù)

3 討 論

四季青水煎液在1×MIC濃度時(shí)，浮泳運(yùn)動(dòng)和蹭行運(yùn)動(dòng)平板中均未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，這與在該濃度下四季青水煎液已經(jīng)能完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)一致.四季青水煎液在1/2×MIC的Sub-MIC下，浮泳運(yùn)動(dòng)和蹭行運(yùn)動(dòng)平板中雖然有菌群生長(zhǎng)，但菌群生長(zhǎng)直徑較空白對(duì)照組比較均有明顯減小(P<0.05或P<0.01)，表明在此Sub-MIC下四季青水煎液雖未對(duì)銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，但能使銅綠假單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力受到明顯抑制.由于細(xì)菌的擴(kuò)散力和侵襲力主要是由細(xì)菌的鞭毛運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生，其受到抑制時(shí)將直接影響細(xì)菌的定植，進(jìn)而影響到生物被膜形成過(guò)程中細(xì)菌的黏附和生物被膜的形成[13-14].四季青水煎液對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜在72 h時(shí)具有較強(qiáng)的消除作用，但由于該項(xiàng)操作是在已經(jīng)生成的生物被膜中加入四季青水煎液后進(jìn)行的，而中途也需要更換新鮮的培養(yǎng)液，導(dǎo)致短時(shí)間(0～24 h)內(nèi)殘留的細(xì)菌得以繼續(xù)產(chǎn)生生物被膜，直至24 h時(shí)生物被膜生成量才開(kāi)始下降，因此，為克服細(xì)菌生物被膜自身生長(zhǎng)規(guī)律的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇24 h時(shí)生物被膜OD值作為基準(zhǔn)，以24 h為起點(diǎn)開(kāi)始觀察，并獲得相應(yīng)的Emax、EC50、E0及γ等參數(shù).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四季青水煎液在1×MIC～1/16×MIC下能消除已生成的生物被膜并具有一定的量-效關(guān)系.綜上所示，四季青在Sub-MIC下能抑制銅綠假單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力和生物被膜的生成，從而降低細(xì)菌的致病性和耐藥性，能夠被人體正常免疫系統(tǒng)清除，從而達(dá)到治療感染的效果，這與中藥主治未病且以調(diào)理為主的理論相吻合.四季青在Sub-MIC消除生物被膜的量-效關(guān)系也為其治療臨床感染的劑量選擇提供了理論依據(jù).