周國俊，馮彥超，黃理政，孫成杰，吳妮莎，侍琳，雷蕾，鐘曉蓉，冷政偉

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽外科二/腫瘤干細(xì)胞研究中心，四川 南充 637000）

肝癌的發(fā)病率及死亡率在世界范圍內(nèi)逐年上升[1]，從組織學(xué)上可將肝癌分為原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌，其中轉(zhuǎn)移性肝癌致死率更高。全球27個肝臟外科中心共3 765例病例分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（colorectal cancer liver metastasis，CRLM）占比已經(jīng)超過肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） （56.4%vs43.6%）。國內(nèi)HCC發(fā)病率相對較高，CRLM有明顯增長[2]，目前轉(zhuǎn)移性肝癌治療上主要依賴早期診斷結(jié)合手術(shù)、放化療、靶向藥物等針對腫瘤細(xì)胞群的綜合治療[3]，然而耐受治療的腫瘤細(xì)胞卻引起了腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，從而導(dǎo)致患者死亡。有科學(xué)家們認(rèn)為，這一類細(xì)胞主要是由腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）組成[4]。所以，獲取CSCs并進(jìn)行研究可能為靶向治療轉(zhuǎn)移性肝癌提供新的方法。

在轉(zhuǎn)移性肝癌中，絕大部分為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移[5]，進(jìn)一步研究證實(shí)是結(jié)直腸癌CSCs介導(dǎo)了CRLM。目前結(jié)直腸癌CSCs的篩選和富集常通過CSCs表面分子為標(biāo)記進(jìn)行免疫磁珠或流式細(xì)胞分選（flow cytometry，F(xiàn)CM）[6]的方法實(shí)現(xiàn)，但此方法獲取的CSCs不僅數(shù)量少而且價格昂貴，難以廣泛應(yīng)用[7-8]。Cariati等[9]研究發(fā)現(xiàn)，無血清懸浮培養(yǎng)可得到具有CSCs特性的球細(xì)胞，為CSCs的獲取提供了替代方法。主要的培養(yǎng)方案為向DMEM/F12培養(yǎng)基中加入胰島素、B27等基礎(chǔ)物質(zhì)后，再加入上皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）[10-11]。bFGF可支持并誘導(dǎo)干細(xì)胞的自我更新及多能性，bFGF單獨(dú)使用也可富集CSCs[12-13]，但采用何種濃度的bFGF培養(yǎng)基及培養(yǎng)多長時間可最大效率地富集CSCs仍未有確切的答案。因此，本實(shí)驗(yàn)以結(jié)直腸癌細(xì)胞為模型，以三種不同濃度的bFGF培養(yǎng)基分別設(shè)置10 d、20 d、30 d三個時間梯度富集CSCs，利用流式細(xì)胞術(shù)、Real-time PCR及Sphereforming assay方法鑒別并比較各組球細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞特性，探究出堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）在富集結(jié)直腸癌CSCs的最佳濃度及時間，為針對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療提供策略。

1 材料和方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌DLD-1細(xì)胞系購買自美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC（American Type Culture Collection，ATCC），DMEM/F12培養(yǎng)基以及1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）購自美國PeproTech公司，Gibco胎牛血清購于美國Amresco公司，胰島素采購于美國Sigma公司，B27因子購自美國Invitrogen公司，CD133-PE、CD44-FITC及相應(yīng)同型對照流式抗體購自德國Miltenyi公司，PCR試劑盒為Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒，引物由美國Invitrogen公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：DMEM/F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清白蛋白（BSA）+5 mg/mL胰島素+B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑（1:50）+100 U/mL鏈霉素+0.1 mg/mL青霉素+不同濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長因子，將分別加入5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL bFGF分組為G1、G2、G3組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：將對數(shù)生長期的DLD-1貼壁細(xì)胞以DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后，消化、懸浮為單個細(xì)胞，計(jì)數(shù)3×104個/mL分別以G1、G2、G3組培養(yǎng)基種入培養(yǎng)瓶，初始體系為20 mL/瓶，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d、20 d、30 d，每隔1 d加2 mL相應(yīng)培養(yǎng)基，每隔7 d換液一次。分別在10 d、20 d、30 d時，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD44+、CD133+、CD44+CD133+的細(xì)胞表達(dá)：取5×105個單細(xì)胞，PBS漂洗2次，向其中加入Staining Buffer封閉液（pH為7.2的PBS，含2% FBS和0.4% BSA），4 ℃封閉l h，離心棄上清，加入25 μL Staining Buffer及相應(yīng)的抗體各1.25 μL，4 ℃避光孵育30 min，再次離心棄上清液，以500 μL PBS懸浮，上機(jī)檢測。

1.2.4 Real-time PCR檢測：細(xì)胞成球后的第10 d、20 d、30 d的球細(xì)胞用氯仿萃取、無水乙醇沉淀后提取mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。選用GAPDH作內(nèi)參，用Takara試劑盒（具體用法按照商家說明），檢測每個樣品中基因的mRNA的表達(dá)量。具體操作步驟參考文獻(xiàn)[14]。Real-time PCR上機(jī)檢測條件：預(yù)熱：95 ℃30 s；三步擴(kuò)增依次為：95 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃10 s；融合依次為：95 ℃ 10 s、65 ℃ 60 s、97 ℃ 1 s；冷卻：50 ℃ 30 s。引物序列詳見表1。

1.2.5 成球?qū)嶒?yàn)（sphere-forming assay）：取成球后第10 d、20 d、30 d的球細(xì)胞各100個，用相應(yīng)組的培養(yǎng)基1 mL，懸浮培養(yǎng)于24孔板，分別在培養(yǎng)后第15 d時記數(shù)球細(xì)胞個數(shù)，并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（±s）表示，組內(nèi)兩兩比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞球中CD44+、CD133+及CD44+CD133+雙陽性的細(xì)胞表達(dá)比例

結(jié)合數(shù)據(jù)分析可知（見表2及圖1），CD44+細(xì)胞比例以G2組20 d表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=98.895，P＜0.05）；CD133+細(xì)胞比例以G3組10 d比例最高，G2組20 d次之，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=147.641，P＜0.05）；CD44+CD133+雙陽性的細(xì)胞比例以G2組20 d與G3組10 d表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.321，P＜0.05），G3組10 d與G2組20 d比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.871，P＞0.05）。

表1 Real-time PCR引物序列

2.2 Real-time PCR檢測球細(xì)胞中的干細(xì)胞基因KLF4、Nanog，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因E-cadherin、Snail，Wnt/β-catenine通路基因Wnt-3a的mRNA表達(dá)情況

結(jié)果顯示（表3），基因KLF4、Nanog、Snail、Wnt-3a均以G2組20 d表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.424、7.694、2.951、3.771，均P＜0.05），基因E-cadherin以G2組20 d表達(dá)最低（除G2組30 d、G1組10 d） （F=10.620，P＜0.05）。

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤干細(xì)胞

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)10 d后CD44+、CD133+及CD44+CD133+細(xì)胞比例

2.3 成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果

G1組10 d、20 d、30 d，G2組10 d、20 d、30 d及G3組10 d、20 d、30 d成球數(shù)量分別為4.667±4.726、46.000±11.136、26.000±4.000，34.333±6.3501、41.333±8.505、18.667±2.309，18.333±3.786、15.333±5.860、15.333±4.509，各組比較G1組20 d和G2組20 d成球數(shù)量明顯多于其他組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.279，P＜0.01），G1組20 d和G2組20 d比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.605，P=0.578），見圖2。

表3 Real-time PCR檢測相關(guān)基因mRNA表達(dá)量

圖2 三組細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果

3 討論

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為CSCs是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的根源細(xì)胞，科學(xué)家主要通過流式細(xì)胞分選、磁珠分選、無血清懸浮培養(yǎng)等方法來獲取CSCs以展開研究。相較于其他方法，懸浮培養(yǎng)法具有操作簡便、成本較低、獲取效率較高及對細(xì)胞無機(jī)械損傷等優(yōu)勢[15]。普通腫瘤細(xì)胞在無血清懸浮培養(yǎng)中，不能貼壁而逐漸死亡，而CSCs則依賴于自我更新能力逐漸得到富集，bFGF在體外培養(yǎng)時濃度從1 ng/mL至50 ng/mL均有報道可促進(jìn)干細(xì)胞自我更新，但不同濃度bFGF在富集CSCs的效能也不同，生長因子bFGF可以促使CSCs體外分裂增殖，利于體外擴(kuò)增，但同時也會通過Wnt/β-catenine通路誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞分化為腫瘤細(xì)胞[16-17]。所以，對bFGF的濃度的選擇以及懸浮培養(yǎng)時間的研究顯得非常重要。本研究以結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞為研究模型，以期確定最優(yōu)的CSCs富集方案，為后續(xù)針對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。

隨著研究的深入，表面標(biāo)記物CD133、CD44成為比較公認(rèn)的結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)識[15]，因此本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞球中的CD44+、CD133+及CD44+CD133+雙陽性的細(xì)胞表達(dá)比例以反應(yīng)CSCs富集情況，分析可知富集CD44+的細(xì)胞以G2組20 d方案最優(yōu)，富集CD44+CD133+雙陽性的細(xì)胞G2組20 d僅次于G3組10 d。CD44作為CSCs的標(biāo)識之一，主要通過逆轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Myc、Twist1等基因，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增值、分化、凋亡等惡性生物學(xué)行為，CD133作為CSCs的標(biāo)識之一，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)時易受多種因素影響，多用于生存率分析、預(yù)測腫瘤預(yù)后、復(fù)發(fā)及耐藥等方面[18-19]。本研究中表達(dá)CD44+的細(xì)胞比例明顯高于CD133+及CD44+CD133+雙陽性的細(xì)胞，G2組20 d富集CD44+的細(xì)胞能力明顯高于其他組合方案，且富集CD44+CD133+雙陽性的細(xì)胞能力僅次G3組10 d，表達(dá)CD133+細(xì)胞的比例并非G2組20 d最高，但CD133+的細(xì)胞比例在所有組數(shù)均較低（小于3%）。

Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，各種基因mRNA均不同程度的高表達(dá)，但E-cadherin低表達(dá)。各組合方案比較，基因KLF4、Nanog、Snail、Wnt-3a均以G2組20 d表達(dá)最高，基因E-cadherin以G2組20 d表達(dá)最低（除G2組30 d、G1組10 d），這表明G2 20 d所富集到的球細(xì)胞具有最強(qiáng)的干細(xì)胞特性，并且具有間質(zhì)細(xì)胞特征，通路Wnt/β-catenine也被激活。研究顯示，腫瘤發(fā)生EMT可以激活腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等方面的重要通路[20]，如TGF-β[21]、Wnt/β-catenine[22]通路等，從而增強(qiáng)細(xì)胞的各種惡性生物學(xué)行為。Lachej等[23]和Pashirzad等[24]認(rèn)為Wnt/β-catenine通路是CSCs自我更新的一個關(guān)鍵調(diào)控位置，Wnt/β-catenine通路中的Wnt-3a不僅可以促進(jìn)腫瘤的分化和遷移，而且還維持細(xì)胞的增殖能力。在我們的實(shí)驗(yàn)中，G2組20 d的方案同其余方案比較表現(xiàn)出了更強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞特征及Wnt/β-catenine通路的激活，結(jié)合其表達(dá)量分析G2組20 d方案的干細(xì)胞基因較其余組也相對高表達(dá)。

成球?qū)嶒?yàn)廣泛用于檢測細(xì)胞的自我更新能力變化，自我更新能力是CSCs能否得到富集的一個重要參考指標(biāo)[25]，本研究中，G2組20 d（除G1組20 d）的成球數(shù)量最多，表明G2組20d的方案可更大限度地促使CSCs的更新，且CSCs分化程度最低，可認(rèn)為G2組20 d與G1組20 d為優(yōu)勢富集方案。

本研究結(jié)果顯示，各組合方案均可富集得到CSCs，但各組之間存在著差異。在FCM結(jié)果中，G2組20 d富集CD133+及CD44+CD133+雙陽性的細(xì)胞能力僅次G3組10 d，但是其余組細(xì)胞在富集CD44+細(xì)胞、干細(xì)胞相關(guān)基因、間質(zhì)基因及Wnt-3amRNA表達(dá)量，以及成球能力方面明顯低于G2組20 d。所以，在結(jié)直腸癌DLD-1懸浮培養(yǎng)富集CSCs的方案中，G2組培養(yǎng)方案懸浮培養(yǎng)20 d為最佳組合方案。目前國內(nèi)外多采用上皮細(xì)胞生長因子和bFGF聯(lián)合培養(yǎng)14 d左右的方法來富集CSCs，但是EGF或bFGF在此過程中的作用如何以及最佳培養(yǎng)時間等問題均未進(jìn)行探討；因此，本研究單獨(dú)探討不同濃度bFGF作用結(jié)直腸癌細(xì)胞不同時間在富集CSCs中的效果，以期為后續(xù)研究bFGF聯(lián)合其他生長因子在富集CSCs中的作用提供前期基礎(chǔ)。但本研究也存在只使用一種細(xì)胞且未對30 d以后的培養(yǎng)時間點(diǎn)進(jìn)行研究，bFGF作用于其他細(xì)胞富集CSCs效率如何？培養(yǎng)超過30 d效率是否有改變等問題均需要更進(jìn)一步深入探討。