沈 揚(yáng),朱 方,沈?yàn)碁?范倩倩,李乙文,程義云,3

(1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海市調(diào)控生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200241;2.四川大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)院,高分子材料工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610065;3.華南理工大學(xué)分子科學(xué)與工程學(xué)院,華南軟物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)高等研究院,廣州 510640)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指通過(guò)外源和內(nèi)源性雙鏈RNA在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的mRNA特異性降解,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一種手段[1,2].自2001年Elbashir等[3]發(fā)現(xiàn)合成的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的RNAi作用后,便開啟了利用可控制的RNAi進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究和新型藥物研發(fā)的領(lǐng)域[4,5].然而,siRNA分子自身不易穿過(guò)細(xì)胞膜,作用過(guò)程中具有的不穩(wěn)定性和脫靶效應(yīng)也阻礙了其有效實(shí)現(xiàn)基因沉默[6,7].因此,安全、高效的遞送載體是RNAi治療中的關(guān)鍵一環(huán)[2].在現(xiàn)有的基因載體中,病毒類載體能夠在多種細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染,但存在安全風(fēng)險(xiǎn).非病毒類載體(主要包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物)往往具有更好的安全性,化學(xué)結(jié)構(gòu)清楚,易于化學(xué)修飾和大規(guī)模制備[8,9].其中,陽(yáng)離子聚合物近年來(lái)已成為載體研究的熱點(diǎn)[10～15].然而,對(duì)于陽(yáng)離子聚合物而言,其遞送效率與細(xì)胞毒性之間往往存在矛盾,即高分子量的陽(yáng)離子聚合物遞送效率高,但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生較高的細(xì)胞毒性; 而低分子量的陽(yáng)離子聚合物雖然生物相容性更好,但其表面正電荷少,與siRNA結(jié)合弱,故而遞送效率也較低[16,17].因此,增強(qiáng)低分子量陽(yáng)離子聚合物與siRNA的結(jié)合能力,提高形成復(fù)合物的穩(wěn)定性是該領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題.

為了解決這一問(wèn)題,我們[18]提出了在轉(zhuǎn)染過(guò)程中加入表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)來(lái)輔助低分子量陽(yáng)離子聚合物遞送siRNA的思路.多酚類材料在藥物遞送領(lǐng)域具有很多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[19,20].天然植物多酚EGCG是茶葉中兒茶素的一種,除了具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基等作用外[21],EGCG還可以通過(guò)氫鍵以及疏水相互作用等與DNA,RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合[22～26].首先利用EGCG與siRNA復(fù)合形成帶負(fù)電荷的超分子納米顆粒,進(jìn)一步在其表面包裹低分子量的陽(yáng)離子聚合物.這種利用植物多酚輔助遞送的方法使低分子量陽(yáng)離子聚合物可以在較低的劑量下將siRNA壓縮成尺寸均一的納米顆粒,顯著地提高了聚合物載體基因沉默效率.這種方法可以適用于不同結(jié)構(gòu)、不同種類的低分子量陽(yáng)離子聚合物.同時(shí),由于EGCG是天然綠茶多酚,具有優(yōu)異的生物相容性,整個(gè)復(fù)合物制備過(guò)程未涉及化學(xué)合成,且最終能實(shí)現(xiàn)高效、低毒的基因轉(zhuǎn)染,因此有望實(shí)現(xiàn)綠色、高效的siRNA遞送[25].

雖然已有研究證明EGCG分子在輔助siRNA遞送方面的潛力,但其化學(xué)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,可進(jìn)一步在結(jié)構(gòu)上拆分為表沒(méi)食子兒茶素[(-)-Epigallocatechin,EGC]和沒(méi)食子酸(Gallic acid,GA)2種植物多酚基元.其中EGC也是茶葉中兒茶素的一種,具有抗氧化、抑制癌細(xì)胞等作用,其活性略低于EGCG,有研究也發(fā)現(xiàn)EGC可以和核酸G-四鏈體結(jié)構(gòu)結(jié)合[27].而GA能夠抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞,同樣具有較強(qiáng)的抗氧化、清除自由基作用,研究發(fā)現(xiàn),具有3個(gè)羥基基團(tuán)的GA可以與H-2鐵蛋白結(jié)合[28].因此,為了進(jìn)一步探究植物多酚基元輔助遞送siRNA的構(gòu)效關(guān)系,本文研究了EGCG,EGC和GA 3種植物多酚基元在結(jié)合核酸的能力和輔助低分子量陽(yáng)離子聚合物遞送siRNA的過(guò)程中所起的作用(Scheme 1).

Scheme 1 Schematic description of the structure-function relationship of plant polyphenols in promoting siRNA delivery mediated by low molecular weight polymers

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG,純度98%,美國(guó)Sigma-Aldrich公司); 表沒(méi)食子兒茶素(EGC,純度98%,上海源葉生物科技有限公司); 沒(méi)食子酸(GA,純度99%)和ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,PLL,分子量4224)均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司; DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司); 熒光素酶檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司); 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株為穩(wěn)轉(zhuǎn)熒光素酶基因的Hela細(xì)胞(Hela-Luc細(xì)胞,ATCC),在37 ℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2環(huán)境下培養(yǎng); siRNA,siRNA-FAM(5′末端標(biāo)記羧基熒光素的siRNA,上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司),其中靶向熒光素酶的siRNA(siLuc)序列如下:

正義鏈(5′-3′)CCCUAUUCUCCUUCUUCGCdTdT

反義鏈(5′-3′)GCGAAGAAGGAGAAUAGGGdTdT

HT7700型透射電子顯微鏡(TEM,日本Hitachi公司),工作電壓為200 kV; Zetasizer Nano ZS90型動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS,英國(guó)Malven公司),分散介質(zhì)為水,測(cè)量溫度25 ℃,溫度平衡時(shí)間2 min,每組樣品測(cè)量3次; F-4500型熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司),激發(fā)波長(zhǎng)為450 nm; 酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司),預(yù)熱30 min以上,波長(zhǎng)595 nm.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 熒光猝滅實(shí)驗(yàn) 將0.5 μg siLuc-FAM分別與2.5 μg EGCG,1.67 μg EGC,0.93 μg GA(EGCG,EGC和GA摩爾比為1∶,1∶,1)于室溫下孵育10 min,將同濃度的siRNA-FAM溶液作為對(duì)照,測(cè)定所得溶液的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)450 nm,發(fā)射波長(zhǎng)475～625 nm).

1.2.2 復(fù)合物的表征 將0.5 μg siLuc分別與2.5 μg EGCG,1.67 μg EGC,0.93 μg GA在室溫下混合孵育20 min,然后每組分別加入2.5 μg PLL,補(bǔ)充100 μL超純水,孵育30 min,通過(guò)DLS測(cè)定復(fù)合物粒徑(檢測(cè)前溶液補(bǔ)充至1 mL),通過(guò)TEM表征復(fù)合物形貌.

1.2.3 基因沉默效率檢測(cè) 在24孔中培養(yǎng)Hela-Luc細(xì)胞12 h(50%匯合度).在檢測(cè)等摩爾EGCG,EGC,GA輔助PLL遞送siRNA的效率時(shí),將0.5 μg siLuc分別與2.5 μg EGCG,1.67 μg EGC,0.93 μg GA在室溫下孵育20 min后,加入2.5 μg PLL和100 μL不含血清的培養(yǎng)基,再孵育30 min后,補(bǔ)充150 μL不含血清的培養(yǎng)基.另外制備siRNA-EGC/GA-PLL(1.67 μg EGC,0.93 μg GA)和siRNA-EGCG/EGC/GA-PLL(1.25 μg EGCG,0.835 μg EGC,0.465 μg GA)2組混合實(shí)驗(yàn)組,材料加入順序與前面一致.在檢測(cè)不同摩爾濃度的EGC輔助PLL遞送siRNA的效率時(shí),將0.5 μg siLuc分別與2.5 μg EGCG,不同質(zhì)量EGC(1.67,3.34,5.01,6.67 μg)在室溫下孵育20 min后,加入2.5 μg PLL和100 μL不含血清的培養(yǎng)基,再孵育30 min后,補(bǔ)充150 μL不含血清的培養(yǎng)基.每1種樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔.細(xì)胞培養(yǎng)基中提前加入羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖溶液(HEPES)維持孵育液pH約7.4.樣品制備完成后,以純EGCG組為陽(yáng)性對(duì)照,板上空出三孔為空白對(duì)照,一起孵育6 h后向培養(yǎng)板中加入500 μL含10%(體積分?jǐn)?shù))血清的細(xì)胞培養(yǎng)基,18 h后處理細(xì)胞.

使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Hela-Luc細(xì)胞中的熒光素酶活性,使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定每孔的蛋白質(zhì)濃度.熒光素酶活性為相對(duì)熒光素酶發(fā)光單位/總蛋白質(zhì)量(RLU/mg protein),以實(shí)驗(yàn)組熒光素酶活性相對(duì)于未經(jīng)處理的空白組熒光素酶活性的百分比來(lái)表示基因沉默效果.

2 結(jié)果與討論

2.1 植物多酚基元與siRNA的相互作用研究

Fig.1 Fluorescence spectra of siRNA-FAM(a),siRNA-FAM/EGCG(b),siRNA-FAM/EGC(c) and siRNA-FAM/GA(d) complex solutionsMolar ratio of EGC and GA to siRNA-FAM is equal to the ratio of EGCG/siRNA-FAM.

為了進(jìn)一步探究EGCG,EGC和GA 3種植物多酚基元輔助遞送siRNA的構(gòu)效關(guān)系,首先研究了這3種植物多酚基元結(jié)合核酸的能力.研究結(jié)果表明,多酚分子能夠通過(guò)協(xié)同的氫鍵和疏水作用結(jié)合siRNA,而這種聚集作用會(huì)導(dǎo)致修飾了熒光素分子的siRNA(siRNA-FAM)發(fā)生熒光猝滅效應(yīng).所以可以通過(guò)熒光猝滅實(shí)驗(yàn)中樣品熒光的減弱來(lái)比較EGCG,EGC和GA與siRNA相互作用的強(qiáng)弱.如圖1所示,在加入了等摩爾的EGCG和EGC后,siRNA-FAM溶液的熒光強(qiáng)度均有顯著降低,其中加入EGCG的樣品熒光下降程度略高于EGC的,而加入等摩爾GA的樣品溶液的熒光強(qiáng)度無(wú)顯著變化.這個(gè)結(jié)果顯示EGCG和EGC都能夠通過(guò)氫鍵和疏水相互作用顯著增強(qiáng)與siRNA的結(jié)合力,而具有鄰苯三酚結(jié)構(gòu)特征的GA卻不能通過(guò)穩(wěn)定結(jié)合siRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)熒光素的熒光猝滅.與GA幾乎不能結(jié)合siRNA-FAM相比,EGC和EGCG都具有結(jié)合siRNA-FAM形成超分子聚集體的能力,只是EGCG的能力更強(qiáng)一些.EGC與EGCG的分子結(jié)構(gòu)特征均含有間苯二酚基團(tuán),同時(shí)它們分子的親疏水平衡性也類似,這些因素或許是多酚基元與siRNA產(chǎn)生較強(qiáng)分子相互作用的核心驅(qū)動(dòng)力.

2.2 植物多酚基元與siRNA形成的復(fù)合物研究

為了進(jìn)一步研究EGCG等3種植物多酚基元輔助陽(yáng)離子聚合物與siRNA形成聚集體復(fù)合物的行為,通過(guò)靜電相互作用將低分子量PLL包裹在上述EGCG,EGC,GA與siRNA形成的復(fù)合物的表面,并借助TEM和DLS對(duì)最終的復(fù)合物溶液聚集態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征.由圖2(A)～(C)可見,在低分子量PLL存在條件下,EGCG可與siRNA形成小于200 nm的均一納米粒子,EGCG的存在顯著提高了siRNA與低分子量PLL之間的相互作用,與siRNA有效地結(jié)合形成超分子聚集體.而在同等條件下,GA輔助形成的粒子則在500 nm左右,且尺寸分布較寬,穩(wěn)定性較差,反映了含有鄰苯三酚基元的GA分子(分子的親水性遠(yuǎn)大于疏水性)并不能與PLL和siRNA一起穩(wěn)定復(fù)合,與2.1節(jié)GA分子與siRNA的結(jié)合較弱的結(jié)果一致.而含有間苯二酚結(jié)構(gòu)的EGC基元輔助PLL與siRNA形成粒子的尺寸為300 nm左右,且具有更均一的形貌,也更接近于EGCG形成的粒子,表明EGC可較為有效地輔助PLL結(jié)合siRNA形成均一的納米顆粒.結(jié)果表明,相比于GA,EGC具有更大的與siRNA形成超分子組裝體的潛力.為了進(jìn)一步研究EGC在輔助PLL與siRNA形成納米復(fù)合物的特征,繼續(xù)研究了不同摩爾量的EGC在輔助PLL與siRNA形成復(fù)合物聚集體的水合動(dòng)力學(xué)半徑和粒子分散度,如圖2(D)和(E)所示,隨著EGC摩爾量的增加,納米復(fù)合物的水合半徑變小,粒徑趨向均一,當(dāng)EGC摩爾量為對(duì)照組EGCG的3倍時(shí),復(fù)合物粒徑達(dá)到最小值.總之,EGCG和EGC均能通過(guò)氫鍵和疏水相互作用增強(qiáng)低分子量陽(yáng)離子聚合物與siRNA的結(jié)合能力,提高形成復(fù)合物的穩(wěn)定性,這是siRNA遞送有效性的關(guān)鍵因素.顯然EGC的效果比EGCG稍弱,但可以通過(guò)增加復(fù)合物中EGC的相對(duì)量來(lái)達(dá)到與EGCG相似的效果.

Fig.2 Size and morphology of the as-prepared complexDLS and TEM images of siRNA/EGCG/PLL(A),siRNA/EGC/PLL(B) and siRNA/GA/PLL(C) complexes.(D) Size and particle distribution index(PDI) of the siRNA/EGC/PLL complex prepared at different EGC to EGCG molar ratios.(E) DLS of the siRNA/EGCG/PLL(a) and siRNA/EGC/PLL(b) complexes.The molar ratio of used EGC to EGCG is 3∶,1.

2.3 植物多酚基元輔助PLL遞送siRNA的效率比較

利用可以穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的Hela細(xì)胞(Hela-Luc)來(lái)系統(tǒng)評(píng)估3種植物多酚基元與PLL以及siRNA形成的共組裝超分子聚集體在遞送siRNA到胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因沉默的效率.如圖3(A)所示,在等摩爾的條件下,EGCG具有更優(yōu)異的輔助PLL遞送siLuc的能力,其參與構(gòu)成粒子的基因沉默效率可達(dá)80%左右; EGC輔助遞送的能力次之,基因沉默效率約為40%左右; 而GA基本上不具備輔助siRNA遞送的能力.與2.1節(jié)三者結(jié)合核酸的能力,以及與PLL和siRNA共組裝形成穩(wěn)定復(fù)合物的能力基本一致.從構(gòu)效關(guān)系來(lái)說(shuō),由EGCG,EGC和GA在結(jié)合siRNA形成超分子聚集體能力的差別可見,植物多酚結(jié)構(gòu)基元上所具有的間苯二酚基團(tuán),以及分子整體的親疏水平衡性可能是決定輔助遞送效率的關(guān)鍵因素.進(jìn)一步研究了幾種多酚基元協(xié)同輔助遞送siRNA在細(xì)胞層面的表現(xiàn).由圖3(A)可見,當(dāng)將siRNA/EGCG/PLL復(fù)合物中的EGCG部分替換為EGC+GA混合物時(shí)(模擬EGCG降解產(chǎn)物),相應(yīng)復(fù)合物的基因沉默效率顯著降低; 而當(dāng)把復(fù)合物中的EGCG完全替換為EGC+GA混合物時(shí),所制得復(fù)合物的敲除效率進(jìn)一步降低.可見,在輔助PLL將siLuc遞送到Hela細(xì)胞實(shí)現(xiàn)基因沉默的過(guò)程中,EGCG具有重要的作用,但EGC同樣具有提高PLL遞送siLuc的潛力,并且在EGCG部分降解時(shí)仍可保持一定的輔助效果.此實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示在長(zhǎng)時(shí)間使用EGCG輔助遞送siRNA時(shí),特別需要注意防止EGCG儲(chǔ)存過(guò)程中的水解副作用(部分水解產(chǎn)物恰好為EGC和GA),以免影響最終的治療效果.最后定量探究了不同摩爾數(shù)的EGC輔助PLL遞送siLuc的效率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(B)所示,當(dāng)EGC的用量增至5.01 μg時(shí)(EGC/EGCG摩爾比為3∶,1),熒光素酶基因的敲除效率顯著增加,達(dá)到60%左右,最接近EGCG輔助PLL遞送siLuc的效率.可見,也可通過(guò)提高EGC在形成超分子聚集體時(shí)的使用量來(lái)達(dá)到較好輔助siRNA遞送的效果,有一定的應(yīng)用意義.

Fig.3 RNAi efficiency of the complexes on Hela-Luc cells(A) Delivery efficiency of siLuc assisted by EGCG(a),EGC(b),GA(c),EGC+GA(d) and EGCG+EGC+GA(e) in the presence of PLL; (B) RNAi efficiency of siRNA/EGC/PLL with different molar ratios of EGC/EGCG.EGCG was shown for comparison.** P < 0.01,*** P < 0.001.

3 結(jié) 論

為了探究植物多酚基元輔助遞送siRNA的構(gòu)效關(guān)系,研究了EGCG,EGC和GA這3種植物多酚基元在結(jié)合核酸的能力和輔助低分子量陽(yáng)離子聚合物遞送siRNA的過(guò)程中起到的作用.結(jié)果表明,3種多酚基元在結(jié)合RNA形成納米復(fù)合物的能力為EGCG > EGC >> GA,通過(guò)增加EGC的濃度可實(shí)現(xiàn)和EGCG相似的核酸復(fù)合效果.研究結(jié)果還表明,EGCG輔助ε-聚賴氨酸(PLL)遞送siRNA的效率最高,EGC次之,而GA的效率最差.同樣可以在遞送過(guò)程中通過(guò)增加EGC的用量達(dá)到與EGCG相似的輔助效果.本文工作可為在天然多酚材料庫(kù)中繼續(xù)尋找和篩選更多具有與EGCG相似化學(xué)結(jié)構(gòu)和輔助遞送效用的天然多酚化合物提供思路,進(jìn)一步為發(fā)展出更多安全、高效的RNAi藥物提供理論支持.