姚蘇芝，趙亮 ，鐘永紅，羅秋蓮，莫靜 ，王怡媛，林翠梧，王立升，羅軒*

(1.廣西大學 化學化工學院，廣西 南寧 530004；2.第二軍醫(yī)大學 東方肝膽外科醫(yī)院，上海 200438)

0 引言

扁桃斑鳩菊(Vernoniaamygdalina)，因其本身帶有苦味又被稱為“苦葉”[1-2]，是菊科(Compositae)植物中的一種，為多年生灌木，高度可達10 m以上，樹干直徑約40 cm[3]。扁桃斑鳩菊不僅廣泛分布在非洲地區(qū)，亞洲地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，在新加坡和馬來西亞尤其常見，在喀麥隆、加納和尼日利亞等許多西非國家，扁桃斑鳩菊的莖和根被當作咀嚼棒，而葉子則成為當?shù)匾环N可食用的葉類蔬菜，是一種藥食兩用植物[4-6]。因其具有重要的藥用價值以及經(jīng)濟發(fā)展?jié)摿?，我國南方部分地區(qū)有專業(yè)種植戶進行種植[7]。至今，有多種活性物質(zhì)從扁桃斑鳩菊中分離得到，如具有抗氧化性的黃酮類[8],具有細胞毒性的倍半萜內(nèi)酯[9-10],具有抗炎作用的甾體皂苷等[11]。

研究表明，扁桃斑鳩菊葉子的提取物具有多種生物活性，其水提取物具有抗氧化活性[12]，丙酮提取物具有驅(qū)蟲作用[13]，醇提取物具有抗菌活性[14]。另外，有文獻報道，扁桃斑鳩菊葉子乙醇提取物和氯仿提取物對MCF-7乳腺癌細胞的增殖具有一定的抑制效果[6,15]。在我國以及全世界范圍內(nèi)，乳腺癌仍然是導致死亡的主要原因之一，因此，對扁桃斑鳩菊提取物的抗乳腺癌有效成分進行研究具有重要意義。到目前為止，對扁桃斑鳩菊中確切的抗乳腺癌活性成分的研究還未見報道。因此，本文通過CCK-8法細胞毒實驗來評價扁桃斑鳩菊葉子不同極性部位提取物對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制效果，并篩選出抗乳腺癌活性最佳的活性部位，為以后進一步探討扁桃斑鳩菊抗乳腺癌活性成分提供方向。

1 實驗

1.1 材料與試劑

材料：扁桃斑鳩菊葉子采摘于廣東省廣州市；人乳腺癌細胞(MCF-7)，生產(chǎn)廠家為南京科佰生物科技有限公司；硅膠板和硅膠，生產(chǎn)廠家為青島海洋化工股份有限公司。

試劑：石油醚(60～90 ℃)、無水乙醇、乙酸乙酯等，以上實驗試劑均為分析純，生產(chǎn)廠家為西隴化工股份有限公司；培養(yǎng)基和PBS，生產(chǎn)廠家為美國Gibco公司，CCK-8，生產(chǎn)廠家為日本同仁化學研究所。

1.2 儀器

RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，生產(chǎn)廠家為鞏義市予華儀器有限公司；MK3型酶標儀和3111型二氧化碳培養(yǎng)箱，生產(chǎn)廠家為美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 扁桃斑鳩菊不同提取方法

將曬干的扁桃斑鳩菊葉子處理為粉末狀，選擇極性不同的溶劑和不同提取溫度，設計了三種提取路線，最終得到各部位提取物。

路線一：200 g扁桃斑鳩菊粉末，先用600 mL石油醚在室溫下提取120 min，重復3次，提取后抽濾，濾渣放置于通風櫥中揮去溶劑，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得石油醚提取物(VA1)；濾渣用600 mL乙酸乙酯在室溫下提取120 min，重復3次，提取后抽濾，濾渣放置于通風櫥中揮去溶劑，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得乙酸乙酯提取物(VA2)；最后用85 %乙醇在室溫下提取濾渣120 min，重復3次，提取后抽濾，棄去濾渣，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得乙醇提取物(VA3)。

路線二：200 g扁桃斑鳩菊粉末，先用600 mL石油醚在50 ℃下提取120 min，重復3次，提取后抽濾，濾渣放置于通風櫥中揮去溶劑，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得石油醚提取物(VA4)；濾渣用600 mL乙酸乙酯在50 ℃下提取120 min，重復3次，提取后抽濾，濾渣放置于通風櫥中揮去溶劑，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得乙酸乙酯提取物(VA5)；最后用85 %乙醇在65 ℃下提取濾渣120 min，重復3次，提取后抽濾，棄去濾渣，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得乙醇提取物(VA6)。

路線三：200 g扁桃斑鳩菊粉末，用600 mL的85 %乙醇提取，提取120 min，重復3次，提取后抽濾，棄去濾渣，合并濾液，濾液經(jīng)減壓蒸餾至提取物無醇味，得到乙醇部位提取物(VA7)。VA7用水分散為懸濁液，加入石油醚進行萃取，萃取至萃取液減壓濃縮后基本無固狀物；懸濁液再加入乙酸乙酯進行多次萃取，減壓蒸餾萃取液獲得醇提乙酸乙酯提取物(VA8)。

三種提取路線得到的各個部位的提取物，各取適量用于MCF-7乳腺癌細胞進行CCK-8細胞毒性實驗。

1.3.2 乙酸乙酯部位提取物粗分

根據(jù)預實驗結果，50 ℃下提取的乙酸乙酯部位提取物具有最好的抗乳腺癌活性，確立了路線二為最佳提取方法，將20 Kg曬干的扁桃斑鳩菊葉子粉碎，按照路線二進行提取，得到約450 g乙酸乙酯提取物(A1)。分別用不同的溶劑體積對A1進行薄層層析分析，結果顯示乙酸乙酯-石油醚溶劑體系具有較好的分離效果，使用該體系對A1洗脫分離。A1溶解后，加入600 g柱層析硅膠攪拌均勻，吸附完全后減壓蒸餾除去溶劑得到拌樣硅膠，拌樣硅膠依次用石油醚、10 %乙酸乙酯-石油醚、20 %乙酸乙酯-石油醚、50 %乙酸乙酯-石油醚、乙酸乙酯和30 %甲醇-乙酸乙酯洗脫，洗脫液減壓濃縮后對應獲得6個洗脫產(chǎn)物A2、A3、A4、A5、A6和A7。對此6個洗脫產(chǎn)物以及A1進行體外抗乳腺癌活性實驗。

1.3.3 CCK-8細胞毒性實驗

對MCF-7細胞進行傳代培育，培育2～3代后，將對數(shù)生長期的MCF-7細胞調(diào)制為懸液(5 ×104個·mL-1)，在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細胞懸液(5 000個細胞·孔)，邊緣孔用PBS 100 μL填充，同時設置不加待測試液的陰性對照孔(吸光值記為OD1)以及不加細胞的空白對照孔(吸光值記為OD0)，將培養(yǎng)板放在5 % CO2、37 ℃恒溫箱中孵育24 h，取出加入試液，每孔加入100 μL不同濃度(10、20、50和100 μg/mL)的試液(吸光值記為OD)，每個濃度設置6個復孔，將培養(yǎng)板放在5 % CO2，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h。取出培養(yǎng)板，將培養(yǎng)基吸出，每孔加入PBS100 μL清洗后棄去，然后每孔加入100 μL培養(yǎng)基，再加入10 μL CCK-8溶液，放在5 % CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中2 h后取出，培養(yǎng)板微微震蕩后置于酶聯(lián)免疫檢測儀上，測量其在450 nm處的吸光值。試液的抑制率公式為

抑制率( %) = 1-(OD-OD0)/( OD1-OD0) ×100 %。

(1)

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果與討論

2.1 扁桃斑鳩菊各個部位提取物體外抗乳腺癌活性

扁桃斑鳩菊各提取物加入CCK-8試劑后培養(yǎng)2 h測定其體外抗乳腺癌活性，活性結果見表1。由表1可知，各部位提取物對MCF-7細胞增殖的抑制效果基本隨著濃度升高而加強，呈劑量依賴性。VA2、VA5、VA7和VA8在濃度為50 μg/mL時，對MCF-7細胞的抑制率均達到了80 %以上，體外抗乳腺活性較好。VA3、VA5和VA7在濃度為50 μg/mL時，體外抗乳腺癌活性差異較為明顯。其中VA7對乳腺癌細胞MCF-7的增殖表現(xiàn)出良好的抑制效果，其抑制率為82.68 %，VA3和VA6對MCF-7細胞的抑制率則均低于25 %，基本不具有抗乳腺癌活性，以上表明了扁桃斑鳩菊中的抗乳腺癌活性部位為乙酸乙酯部位。

表1 扁桃斑鳩菊各個部位提取物體外抗乳腺癌活性Tab.1 In vitro anti-breast cancer activity of extracts from Vernonia amygdalina

2.2 乙酸乙酯提取物及其粗分各段提取物體外抗乳腺癌活性

乙酸乙酯提取物A1及其洗脫產(chǎn)物A2-A7加入CCK-8試劑后培養(yǎng)2 h測定其體外抗乳腺癌活性，活性結果見表2。由表2可知，A1-A7對MCF-7細胞增殖的抑制作用基本隨著濃度升高而加強，呈劑量依賴性。使用石油醚、10 %乙酸乙酯-石油醚和20 %乙酸乙酯-石油醚3種低極性洗脫劑得到的組分A2、A3和A4對MCF-7乳腺癌細胞增殖的抑制效果一般；濃度為100 μg/mL時，使用50 %乙酸乙酯-石油醚、乙酸乙酯和30 %甲醇-乙酸乙酯3種中強極性溶劑得到的洗脫產(chǎn)物A5、A6和A7，對MCF-7乳腺癌細胞的增殖均具有較好抑制作用，且抑制效果均優(yōu)于A1，特別是A5在濃度為100 μg/mL時，抑制率達到了80 %以上，由此可知，A5、A6和A7三個洗脫產(chǎn)物為乙酸乙酯提取物中的抗乳腺癌活性段，可做進一步分離純化。

表2 乙酸乙酯提取物及其粗分各段提取物體外抗乳腺癌活性Tab.2 In vitro anti-breast cancer activity of ethyl acetate extracts and its subfractions

3 結語

本研究結果顯示扁桃斑鳩菊的中等極性部位，即乙酸乙酯部位，對 MCF-7乳腺癌細胞的增殖具有較為明顯的抑制作用。而對該部位進行粗分后的活性追蹤表明A5、A6和A7這三個洗脫產(chǎn)物具有較好的抗乳腺癌活性，其中活性最強的組分為A5。對此三個活性段，特別是A5，可做進一步的分離純化，明確扁桃斑鳩菊中抗乳腺癌的有效成分。扁桃斑鳩菊中等極性溶劑的提取物主要含有倍半萜內(nèi)酯等物質(zhì)，且倍半萜內(nèi)酯具有一定的細胞毒活性。本文推測，扁桃斑鳩菊提取物中抗乳腺癌活性成分可能是倍半萜內(nèi)酯類成分。本研究為后期研究扁桃斑鳩菊中單個或者一系列具有抗乳腺癌活性的單體化合物奠定了基礎。