梁飛燕，林小瑩，辛麗娜，葉勇，陳圣杰，王捷*

(1.廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 南寧 530021； 2.廣西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530021)

0 引言

氯羥吡啶又稱二氯二甲吡啶酚、克球酚，對(duì)雞9種艾美耳球蟲(chóng)均有良好的防治效果，是目前國(guó)內(nèi)使用最廣泛的抗球蟲(chóng)藥之一，在國(guó)際上使用也較多。氯羥吡啶有一定的致畸作用和胚胎毒作用。不遵守休藥期規(guī)定、超劑量使用、飼料中非法添加等操作，均有可能導(dǎo)致氯羥吡啶在雞體內(nèi)和雞蛋中的殘留。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告及2019年9月6日發(fā)布并于2020年4月1日實(shí)施的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》(GB 31650—2019)中對(duì)雞/火雞的肌肉、肝、腎的獸藥殘留做出了限量要求，卻沒(méi)有對(duì)雞蛋中氯羥吡啶的殘留量做出規(guī)定。2019年4月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部官網(wǎng)發(fā)布了《2019年動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃》中指出雞蛋中不得檢出氯羥吡啶。為此，考察和研究氯羥吡啶在禽蛋中的殘留水平和現(xiàn)狀，對(duì)制定禽蛋中氯羥吡啶的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)、保障禽蛋質(zhì)量安全均具有重要意義。

關(guān)于雞蛋中氯羥吡啶的檢驗(yàn)方法，我國(guó)目前現(xiàn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)有《雞蛋中氯羥吡啶殘留量的檢測(cè)方法 高效液相色譜法》(GB/T 20362—2006)、《出口動(dòng)物源食品中抗球蟲(chóng)藥物殘留量檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》(SN/T 3144—2011)。《雞蛋中氯羥吡啶殘留量的檢測(cè)方法 高效液相色譜法》采用色譜法進(jìn)行測(cè)定，專屬性差，靈敏度低，已不適應(yīng)當(dāng)前痕量組分分析的儀器設(shè)備要求；《出口動(dòng)物源食品中抗球蟲(chóng)藥物殘留量檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定，儀器靈敏度高，但凈化過(guò)程采用常規(guī)的固相萃取法，要經(jīng)過(guò)活化、平衡、上樣、淋洗、洗脫共5個(gè)步驟，操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)。目前，關(guān)于禽蛋中氯羥吡啶殘留檢測(cè)方法的文獻(xiàn)報(bào)道甚少，而且大都采用了高效液相色譜法[1-2]或常規(guī)的固相萃取法[3]。為此，筆者研究了一種樣品前處理簡(jiǎn)單、快速、靈敏、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的禽蛋中氯羥吡啶殘留的反相固相萃取(RSPE)-超高效液相色譜(UPLC)-串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)的檢測(cè)方法，并對(duì)當(dāng)前雞蛋中氯羥吡啶的殘留現(xiàn)狀進(jìn)行了考察。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

ExionLC液相色譜-AB 6500三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)AB SCIEX公司)；ML204電子天平(梅特勒-托利多國(guó)際有限公司)；KS 260渦旋振蕩儀(德國(guó)IKA集團(tuán))；ST 40R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司);AutoVap S60氮吹儀(美國(guó)ATR公司)。

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純(美國(guó)默克公司)；水為Millipore超純水；Oasis PRIME HLB固相萃取小柱(500 mg,6 cc，沃特世科技有限公司)；氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)品含量98.85 %(美國(guó)Stanford Chemicals公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)品適量至棕色瓶中，用甲醇溶解，配制成濃度為1 000 μg/mL的溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成100 μg/mL的溶液。

1.3 樣品前處理

取禽蛋樣品去殼后均質(zhì)，稱取2.50 g(精確到0.01 g)置于50 mL離心管中，用乙腈∶水(90∶10，v/v)定容至10.0 mL，于渦旋振蕩器中渦旋10 min，10 000 r/min 5 ℃離心5min。取上清液置于Oasis PRIME HLB固相萃取柱(500 mg，6 cc)中，待其自然流出，收集流出液4.0 mL于15 mL離心管中，40 ℃水浴氮?dú)獯抵两?，殘?jiān)靡译妗盟?10∶90，v/v)定容至1.0 mL，渦旋震蕩2 min復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜后待上機(jī)測(cè)定。

1.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的制備

精密量取標(biāo)準(zhǔn)使用液適量，氮?dú)獯蹈?，加入?.3節(jié)樣品前處理得到的空白基質(zhì)溶液1.0 mL，得到濃度為0.5～20 ng/mL的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件

CAPCELL PAK C18MGⅢ-H色譜柱(3 μm，2.0 mm×100 mm)；流動(dòng)相為0.1 %甲酸溶液A-乙腈B，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；流速為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Mobile phase gradient elution procedure

1.5.2 質(zhì)譜條件

電離方式為電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描；采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；電噴霧電壓(IS)為5 500 V，離子源溫度(TEM)為400 ℃，氣簾氣流速為35 L/min，霧化氣流速為55 L/min，輔助加熱氣流速為55 L/min，射入電壓為10 V。氯羥吡啶的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2，氯羥吡啶總離子流圖見(jiàn)圖1。

表2 氯羥吡啶質(zhì)譜采集參數(shù)Tab.2 MS acquisition parameters of clopidol

圖1 氯羥吡啶總離子流圖Fig.1 Total ion current of clopidol

2 結(jié)果和討論

2.1 提取溶劑的選擇

合理選擇提取溶劑，不僅能有效提取待測(cè)組分，還可以阻止干擾組分進(jìn)入提取液中，降低基質(zhì)干擾。氯羥吡啶為吡啶類化合物，在甲醇或乙醇中極微溶，在水、丙酮、乙醚、苯中不溶,在氫氧化鈉中溶解。雞蛋含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)，乙腈可沉淀蛋白。通過(guò)查閱相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[4-7]，氯羥吡啶的檢測(cè)均采用乙腈做為提取溶劑。為此，本研究考察了不同比例的乙腈溶液[無(wú)水乙腈、乙腈∶水(90∶10，v/v)、乙腈∶水(80∶20，v/v)、乙腈∶水(70∶30，v/v)]對(duì)氯羥吡啶的提取效率和基質(zhì)干擾程度，結(jié)果表明乙腈含量越高，沉淀蛋白能力越強(qiáng)；同時(shí)因雞蛋中含有豐富脂溶性物質(zhì)(葉黃素和玉米黃素等)，乙腈含量越高，進(jìn)入提取液的脂溶性物質(zhì)越多，為此得到的提取液顯示的黃色越深，基質(zhì)干擾也越大。通過(guò)比較得出，采用乙腈∶水為90∶10(v/v)時(shí)提取回收率較高，峰形較好，所以本研究選擇乙腈∶水為90∶10(v/v)作為提取溶劑。

2.2 固相萃取柱的選擇

PRiME HLB固相萃取柱[8-11]是一種新型的反相固相萃取吸附劑，可以吸附樣品中的非極性干擾物但不影響目標(biāo)物的回收率，尤其是對(duì)于造成基質(zhì)干擾的脂肪和磷脂，去除效率高達(dá)95 %以上，從而達(dá)到最簡(jiǎn)單的過(guò)濾式樣品制備流程，實(shí)現(xiàn)樣品純化的目的。為此，筆者考察了PRiME HLB固相萃取柱對(duì)樣品的凈化效果，通過(guò)與含HLB和MCX吸附劑的固相萃取柱比較發(fā)現(xiàn)：PRiME HLB固相萃取柱純化速度快、操作簡(jiǎn)單、基質(zhì)干擾小，氯羥吡啶的峰型和回收率均優(yōu)于使用HLB和MCX吸附劑的固相萃取柱。故采用PRiME HLB固相萃取柱作為純化柱。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限

按照1.4節(jié)配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液，以1.5節(jié)的色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，考察氯羥吡啶的線性。結(jié)果以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。測(cè)得氯羥吡啶在0.5～20 ng/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，詳見(jiàn)圖2，線性方程為y=3.689 0×105x+15 990，相關(guān)系數(shù)為0.999 2。在空白雞蛋中添加適量的氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3節(jié)配制檢出限溶液和定量限溶液，以定量離子的信噪比S/N=3、S/N=10分別計(jì)算檢出限和定量限，得到本方法氯羥吡啶的檢出限為0.001 3 μg/kg，定量限為0.004 5 μg/kg。

圖2 氯羥吡啶工作曲線Fig.2 Working curve of clopidol

2.3.2 回收率和精密度

采用加標(biāo)回收法，在雞蛋空白樣品中添加3種不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.4、1.0、4.0 μg/kg，一式3份，按擬定的方法和條件進(jìn)行前處理，得到回收率溶液上機(jī)測(cè)定回收率和精密度。結(jié)果顯示，3種濃度水平的回收率分別為105.90 %、106.82 %、101.65 %，RSD分別為1.53 %、1.11 %、2.91 %，詳見(jiàn)表3，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗(yàn)》(GB/T 27404—2008)附錄F 檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求中的相關(guān)規(guī)定。

表3 方法回收率及精密度Tab.3 Result of tests for recovery and precision (n=3)

3 禽蛋中氯羥吡啶殘留現(xiàn)狀的考察

本次考察從流通環(huán)節(jié)共采集禽蛋樣本82批次，采用具體方法對(duì)氯羥吡啶的殘留進(jìn)行了篩查檢測(cè)，結(jié)果3批次禽蛋檢出氯羥吡啶的檢出率為3.66 %，樣品檢出氯羥吡啶的測(cè)定值見(jiàn)表4。

表4 氯羥吡啶測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination results of clopidol

氯羥吡啶為廣泛用于家禽球蟲(chóng)病的藥物，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第278號(hào)公告中規(guī)定氯羥吡啶預(yù)混劑在產(chǎn)蛋期為禁用藥物，本研究檢出禽蛋中氯羥吡啶的殘留，可能為養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過(guò)程沒(méi)有遵守休藥期規(guī)定而造成。為此，指導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)、合理用藥，提高養(yǎng)殖戶的安全和風(fēng)險(xiǎn)意識(shí)，對(duì)于降低獸藥殘留風(fēng)險(xiǎn)、提高禽蛋質(zhì)量具有重要意義。

4 結(jié)論

本次研究建立的禽蛋中氯羥吡啶殘留的RSPE-UPLC-MS/MS方法，具有操作簡(jiǎn)單快速、方法準(zhǔn)確度高、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，滿足食品檢測(cè)方法的技術(shù)要求，可用于禽蛋中氯羥吡啶殘留的篩查檢驗(yàn)，為監(jiān)管部門(mén)實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支持，對(duì)禽蛋質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控和質(zhì)量安全的提高具有重要價(jià)值。