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        冠突散囊菌發(fā)酵苦丁茶工藝研究

        2020-04-13 13:33:54陳敏謝發(fā)游玲王濤
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年6期
        關鍵詞:苦丁茶磚茶菌絲

        陳敏,謝發(fā),游玲,2,王濤,2*

        1(宜賓學院 生命科學與食品工程學院,四川 宜賓, 644000)2(固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室,宜賓學院,四川 宜賓, 644000)

        冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)是主要存在于茯磚茶中的一種益生真菌,可產生金黃色閉囊殼,即“金花”[1],該菌是影響茯磚茶品質的重要因素,不僅可以降低茶的澀味,其菌花香及產生的色素都可增強茶的品質[2]。該菌的代謝產物具有降脂、抗腫瘤細胞活性、促消化等多種功效,菌絲體營養(yǎng)豐富且對人體無毒害[3-7],常見應用于黑茶[8]的發(fā)酵,目前也見中草藥[9-10]、食品[11-12]發(fā)酵。

        小葉苦丁茶是由木犀科女貞屬粗壯女貞(Ligustrumrobustum)的鮮葉經殺青、脫水解塊、揉捻、粗烘、二次揉捻、干燥、精制而成,具有多種保健功能[13],本研究借鑒茯磚茶“散茶發(fā)花”[14]技術,通過接種冠突散囊菌發(fā)酵苦丁茶,賦予其“菌花香”,減少其苦味和粗青氣,為苦丁茶新產品開發(fā)提供新思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        小葉苦丁茶,由四川省筠連縣冬青御品科技有限公司提供。冠突散囊菌(CICC 2422),購于中國工業(yè)微生物保藏中心。CZG培養(yǎng)基(g/L):蔗糖40,NaCl 50,K2HPO41,NH3NO33,MgSO4·7H2O 0.5。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 液體菌種條件優(yōu)化

        以CZG液體培養(yǎng)基為基準培養(yǎng)基,裝液量300 mL/L,28 ℃,120 r/min,培養(yǎng)5 d為基準條件,菌絲干重、菌絲球大小及有性孢子量為評估指標,對蔗糖質量分數(6%、4%、2%)、NaCl質量分數(6%、4%、2%)、pH(4.5、5.5、6.5)采用IBM SPSS Statistics19軟件設計正交實驗。菌絲干重計量方法、菌絲球大小測量方法分別參照文獻[15-16],有性孢子評估方法為以肉眼評判菌液黃色深淺。

        在優(yōu)化后的CZG培養(yǎng)基(蔗糖60 g/L、NaCl 40 g/L、pH 6.5)中,以28 ℃、培養(yǎng)5 d為基礎條件,評估指標同上,圍繞轉速(140、120、100 r/min)、接種量(12%、10%、8%)、裝液量(300、250、200 mL/L)采用上述軟件設計正交實驗,優(yōu)化培養(yǎng)條件。

        1.2.2 冠突散囊菌發(fā)酵工藝

        小葉苦丁茶中加入一定量的無菌水后,70 ℃汽蒸20 min,自然冷卻后取100 g于1 L錐形瓶中,接種10 mL液體菌種,發(fā)酵12 d(前8 d 28 ℃,后4 d 30 ℃),70 ℃干燥90 min。肉眼評判的菌絲覆蓋度為評估指標,單因子試驗方法先后探究了接種菌齡、茶葉含水量(mL/g)對發(fā)酵的影響。菌齡設定分別為2、3、4、6、8、10 d(含水量為30%);含水量(質量分數)分別設定為20%、 25%、 30%、 35%。

        1.2.3 揮發(fā)性物質檢測

        前處理:0.4 g原葉,發(fā)酵10、12 d的苦丁茶,0.6 g NaCl于20 mL頂空瓶中,加入2 mL沸蒸餾水密封。60 ℃水浴15 min,使用65 μm PDMS/DVB固相微萃取頭頂空吸附60 min,230℃解析5 min進樣,采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(7890A-5975C,Agilent)檢測其揮發(fā)性成分。

        色譜柱條件:HP-5MS彈性石英毛細管柱(300 mm×0.25 mm×0.25 μm)分析樣品揮發(fā)性成分,載氣為高純He,流速0.8 mL/min,柱溫40 ℃,保持2 min,以2 ℃/min升至110 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升溫至170 ℃,保持2 min,以10 ℃/min升至260 ℃,保持5 min;進樣溫度300 ℃,接口溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃;EI電子能量70 eV,掃描范圍45~350 amu。

        1.2.4 茶葉感官審評

        組織12位經專業(yè)培訓的人員,根據GB/T 23776—2018,采用輕松感官分析系統(tǒng),對樣品進行定量描述分析和成對偏愛調查。

        2 結果與分析

        2.1 液體菌種制備工藝優(yōu)化

        培養(yǎng)基成分含量和培養(yǎng)條件對冠突散囊菌生長的影響如表1和表2所示。

        由表1可知,pH 6.5、蔗糖6%(質量分數)、NaCl 4%(質量分數)的條件下菌絲體生物量最高,菌液顏色最深,菌絲蓬松,菌絲球大小與其他組合差異不大。由于菌液黃色深淺是有性孢子數量的直觀呈現[17],同時菌絲球大小影響菌種接種在物料上的分散度,從而影響發(fā)酵的均勻度,綜合評估,確定該培養(yǎng)基組合為最佳,與其他研究者類似研究[17]結果相符。在pH 6.5的組合下,菌絲干重、菌液顏色的結果均優(yōu)于其他組合,可見pH為菌絲體生物量和有性孢子量的主要影響因素。

        由表2可知,組合2、4的條件下菌絲體生物量高,菌液顏色最深,菌絲球較小,菌絲狀態(tài)與其他組合一致,但組合4裝液量更少,確定組合2為最佳培養(yǎng)條件。9種組合中,轉速相同時,裝液量增加,菌絲球體積趨于增大;裝液量相同時,轉速增加,菌液顏色趨于加深,表明菌絲球大小、有性孢子量分別與裝液量、轉速呈一定的正相關關系。

        表1 培養(yǎng)基成分對冠突散囊菌生長的影響

        注:菌絲球大小,“+”表示直徑約1 mm;“++”表示直徑約2 mm;以此類推(下同)

        表2 培養(yǎng)條件對冠突散囊菌生長的影響

        注:菌液顏色“+”表示不變黃;“++”表示微黃;“+++”表示黃;“++++”表示深黃

        2.2 發(fā)酵參數對冠突散囊菌培養(yǎng)物的影響

        茶葉含水量和接種菌齡對冠突散囊菌菌絲生長的影響如圖1和圖2所示。

        如圖1所示,當含水質量分數為35%和30%時,延滯期最短,發(fā)酵4和8 d,菌絲覆蓋度分別達到30%和80%以上,10 d即完全覆蓋,周期最短。前者發(fā)酵4 d后,菌絲生長狀況較后者略差,可確定30%含水質量分數為發(fā)酵最佳,低于茯磚茶發(fā)酵所需水分的10%[18],也進一步說明30%(質量分數)左右的水分條件已達到冠突散囊菌生長需求,水含量過高或過低都會影響其生長。從菌絲生長的各階段來看,延滯期最長8 d,最短3 d;進入指數期后,菌絲覆蓋速率在含水質量分數最佳(30%)與最低(20%)的條件下可分別達到30%/d和10%/d,后者最終不能完全覆蓋,可見水分含量對發(fā)酵的整個階段均有顯著影響。

        圖1 水分含量對冠突散囊菌生長的影響

        如圖2所示,菌齡為4 d的菌種,接種后延滯期最短,發(fā)酵4和8 d,菌絲覆蓋度分別達到30%和90%,10 d完全覆蓋,周期最短??纱_定接種菌齡4 d最佳。不同菌齡間延滯期相差最多4 d;菌齡8、10 d的菌種雖最終不能完全覆蓋,但進入指數期后,其菌絲覆蓋速率在6~8 d略高于短菌齡菌種,可見菌齡主要影響延滯期與發(fā)酵周期。

        圖2 菌齡對苦丁茶發(fā)酵的影響

        2.3 苦丁茶發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質的變化

        苦丁茶發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質種類的變化如圖3,表3~表5所示。

        由圖3可知,3個階段的樣品共檢測出58種物質,其中苦丁茶原葉26種,發(fā)酵10 d的樣品31種,發(fā)酵12 d的樣品32種。3個樣品共有相同物質11種(具體物質見表4),原葉中的8種物質消失(具體物質見表3);發(fā)酵10、12 d的樣品分別新增15、18種物質,而且這些物質僅有3種在2階段同時存在(具體物質見表4);反,順-2,6-壬二烯醛、5-甲基呋喃醛、香葉基丙酮、1-乙酰環(huán)己烯、甲基庚烯酮5種物質在原葉、發(fā)酵10 d的樣品中檢出;萜品烯、2,4-二叔丁基苯酚2種物質在原葉、發(fā)酵12 d的樣品中檢出。說明苦丁茶接種“金花”菌發(fā)酵及發(fā)酵的過程中揮發(fā)性物質發(fā)生了復雜而顯著的變化。

        圖3 苦丁茶原葉、發(fā)酵10 d、發(fā)酵12 d的苦丁茶揮發(fā)性物質種類

        表3 原葉中消失的物質

        由表4可知,發(fā)酵10和12 d新增兩階段新增物質交叉少、基數小、種類多,而且僅分別有3、4種物質從茯磚茶中被檢出[19-23],表明隨著發(fā)酵的進行,物質變化在持續(xù),物質成分與茯磚茶有較大的差異。

        由表5可知,發(fā)酵10 d的樣品中檸檬醛、香葉醛為含量最多的2種物質,占到了54.05%,相對苦丁茶原葉共增加了24.45%,但在發(fā)酵12 d的樣品中含量則下降為12.55%。發(fā)酵12 d的樣品中桉葉油醇、芳樟醇含量最多,占到了45.21%,相對原葉和發(fā)酵10 d的樣品分別共增加了22.34%和37.91%。這些顯示不同發(fā)酵階段樣品中揮發(fā)性主體物質也發(fā)生了巨大的變化。

        芳樟醇和癸醛是所有物質中隨著發(fā)酵的進行其含量持續(xù)上升的物質,其中芳樟醇的變化趨勢與在茯茶發(fā)酵研究[19]的結果是一致的。甲基庚烯酮在原葉中含量高(7.97%),在發(fā)酵10 d的樣品中僅為0.93%。從芳樟醇、甲基庚烯酮變化規(guī)律來看,這2種物質具備成為生產監(jiān)控指標物質的可能性,但需進一步驗證。

        表4 發(fā)酵10、12 d新增物質

        注:—表示未檢測到相應物質;*表示茯磚茶中檢出物質

        表5 三個樣品中相同的揮發(fā)性物質

        此外,發(fā)酵10、12 d的苦丁茶所呈現出的物質差異和感官特征差異均較明顯,綜合前述物質比較分析,發(fā)酵10 d可作為一個發(fā)酵節(jié)點,但還需結合茶湯感官特征、菌體色澤、生產周期確定發(fā)酵周期。

        2.4 發(fā)酵苦丁茶的感官評價

        發(fā)酵后苦丁茶表面遍布金黃色培養(yǎng)物。從感官評價雷達圖(圖4)可知,發(fā)酵10 d后,感官風味變化明顯,茶湯苦味消失,粗青氣、植物香顯著下降,有菌香和淡淡的甜香,湯色橙黃明亮,滋味醇和,有綿滑感;繼續(xù)發(fā)酵2 d(發(fā)酵12 d),茶湯感官變化不大。同時,75%的人更喜歡發(fā)酵后的苦丁茶。

        綜合發(fā)酵參數、感官特征和生產效率,確定優(yōu)化后的工藝為蔗糖質量分數6%、NaCl質量分數4%、pH 6.5的CZG培養(yǎng)基(裝液量1/4),140 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)制備冠突散囊菌液體菌種,培養(yǎng)4 d后接種到70 ℃汽蒸20 min滅菌后的苦丁茶中,調整含水量為30%,28 ℃發(fā)酵8 d后升溫至30 ℃,繼續(xù)發(fā)酵2 d,70 ℃烘90 min。

        圖4 冠突散囊菌對苦丁茶感官風味的影響

        3 結論

        本文首次將冠突散囊菌應用于苦丁茶發(fā)酵,發(fā)酵工藝與茯磚茶相比,時間更短,工藝更簡潔[24];而物料含水量、發(fā)酵溫度等發(fā)酵參數差異不大[14],在一定程度上與茯磚茶發(fā)酵的實際工藝研究相吻合。

        苦丁茶接種“金花”菌發(fā)酵后,感官特征明顯改善;發(fā)酵過程中,揮發(fā)性物質持續(xù)變化,尤其是揮發(fā)性主體物質大幅度改變,酮類物質減少,酯類物質持續(xù)增加。

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