戴媛媛，汪曉河，馬明華，計強國，顧小燕，吳鐵軍，年 華 （.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院藥劑科，上海 00437；.上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 00090）

夏枯草消瘤合劑由中藥夏枯草、牡蠣、生地黃、莪術、蒼術、白術組成，是中醫(yī)腫瘤學專家錢伯文教授的經驗方。方中諸藥配伍，以達化痰軟堅，活血化瘀，補養(yǎng)氣血的功效。其臨床實驗研究已證實，該藥配合一線化療方案治療中晚期非小細胞肺癌患者，有助于提高患者的生存治療和減少化療所產生的毒副作用[1]。由該方制成的合劑在我院臨床使用多年，前期研究對于組方中化學成分的研究仍限于迷迭香酸、咖啡酸的穩(wěn)定性研究[2]。盡管方中一些單味藥的化學成分已有報道[3-18]，但是整個復方制劑的化學成分未見報道。由于組分的復雜性，復方的成分分析比單味藥更具有挑戰(zhàn)性，明確夏枯草消瘤方色譜圖中各個色譜峰歸屬對于該復方的質量控制及體內深入研究具有重要意義。

高效液相-高分辨飛行時間質譜（HPLCTOF/MS）串聯(lián)技術對于中藥復雜體系中化學成分分析和鑒定非常有效。其靈敏度高、操作簡便、耗時短，可以在短時間獲得化合物準確的相對分子質量，通過與所建立的已知化學成分數據庫比對，可以快速的對被測成分進行分析鑒別[19-20]。因此，本文采用HPLC-TOF/MS 技術，首次對夏枯草消瘤方中化學成分進行鑒別，并且對各成分進行藥材歸屬，以進一步闡明夏枯草消瘤方的化學物質基礎。

1 材料和方法

1.1 儀器

Agilent 1100 系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），配有在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱和二級管陣列檢測器；Agilent 6220 高分辨飛行時間質譜儀（美國安捷倫公司），配有標準電子噴霧離子源（ESI）；分析軟件為 MassHunter 數據采集在線工作站和Qualiative Analysis 離線分析軟件。

1.2 藥品與試劑

咖啡酸（批號：110885-200102，純度＞98.5%）、迷迭香酸（批號：111871-201505，純度＞98.5%）對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇和甲酸為色譜純（Fisher，USA），其余試劑均為分析純，水為純水。

夏枯草、生地黃、莪術、麩炒蒼術、麩炒莪術、牡蠣、煅牡蠣均由上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院中藥房提供（見表1）。藥材及飲片均經第二軍醫(yī)大學藥學院生藥學教研室黃寶康教授鑒定。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取咖啡酸、迷迭香酸對照品3.22、5.68 mg 置10 ml 量瓶中，加甲醇稀釋定容，配成濃度分別為322、568 μg/ml 的母液，精密吸取母液1 ml 置于 10 ml 量瓶，加甲醇定容后，即得對照品溶液。

表 1 藥材信息

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取夏枯草4.2 g、牡蠣8.4 g、煅牡蠣8.4 g、地黃4.2 g、莪術4.2 g、白術（麩炒）2.1 g、蒼術（麩炒）2.1 g，以上七味，充分潤濕，分別加8 倍量與4 倍量水煎煮兩次，每次煮沸后于85 ℃保溫20 min，煎液濾過，合并濾液，濾液濃縮至相對密度1.10 以上（80 ℃），離心，取上清液；精密吸取夏枯草消瘤方溶液上清液5 ml，置于50 ml 容量瓶中，加甲醇定溶，搖勻，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得夏枯草消瘤方樣品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：ACE C18（3.0 mm×150 mm），流動相A 相為甲醇，B 相為水（含0.1%甲酸），梯度洗脫：0～5 min：5%A，5～10 min：5%～15%A，10～30 min：15%～45%A，30～40 min：45%～70%B，40～50 min：70%～90%B；進樣量2 μl，流速為0.4 ml/min；柱溫為25 ℃；運行時間為50 min。

2.4 質譜條件

采用ESI 離子源，正、負離子模式均進行檢測，霧化器為高純氮氣，具體參數如下：正離子模式：毛細管電壓3500 V，干燥器溫度350 ℃，干燥器流速10L/min，霧化器壓力40 psig，碎片電壓160 V；參比離子m/z121.9856，1033.9881；掃描范圍m/z100-1200。測定樣品之前，使用調諧液校準質量軸，以保證質量精度誤差小于1×10-6。

2.5 夏枯草消瘤方化學成分數據庫的建立

根據國內外專業(yè)數據庫中科院化學專業(yè)數據庫、Pubmed、Chemspider 等，以及國內外相關研究文獻，收集了夏枯草消瘤合劑方中六味中藥化學成分名稱及分子式共760 個。采用安捷倫“formuladatabase generator”軟件（含各元素精確質量數），根據各成分碳、氫、氧的個數，計算精確相對分子質量、M+H 和M-H 準分子離子峰相對分子質量的相應的化學成分數據庫。

3 結果和討論

3.1 夏枯草消瘤合劑的相關圖譜

夏枯草消瘤方樣品溶液的總離子流圖見圖1。其中圖1A 為正離子160 V 模式，圖1B 為負離子160 V 模式，圖1C 為負離子260 V 模式。

3.2 利用對照品鑒別化合物

實驗中利用已有的2 個對照品，在負離子模式、碎片電壓160 V 條件下，無偏差的鑒別出咖啡酸、迷迭香酸，對照品總離子流圖見圖2。

3.3 利用精確質量數和同位素分布鑒別化合物

正離子模式下以圖1 中2 號峰疣孢酚為例，說明夏枯草消瘤方色譜峰的鑒別過程。保留時間為24.032 min，色譜圖中的準分子離子為267.1591。利用Qualiative Analysis 數據分析軟件的計算功能計算精確質量數的可能元素組成（5×10-6），并比對數據庫中已知化合物的質荷比，初步確定元素組成為C15H22O4，為疣孢酚的(M+H)+。計算該準分子離子的核素分布情況，從圖3A 可以看出同位素分布的理論值（方框所示）與實際值（方框內峰所示）吻合良好，確定此峰為疣孢酚。同理可得負離子模式下圖1 中18 號峰，地黃苷D 的解析過程（圖3B）。

圖 1 夏枯草消瘤方 TOF/MS 總離子圖

圖 2 對照品 TOF/MS 總離子流圖

圖 3 夏枯草消瘤方同位素分布圖

3.4 夏枯草消瘤合劑化學成分鑒別結果

根據飛行時間質譜測得精確的相對分子質量，比對所建立的數據庫，應用Qualiative Analysis 質譜分析軟件計算分子組成，將理論值與實測值進行比對，結合上述對照品鑒別結果及相關文獻報道，對夏枯草消瘤合劑中藥材在正、負離子模式下所得色譜圖中色譜峰進行分析，初步鑒別出37 個化學成分，結果見表2、表3。對于部分未見區(qū)分的同分異構體，后期可考慮調節(jié)碎片電壓獲得化合物的裂解規(guī)律進行區(qū)分。

3.5 討論

對色譜條件的摸索，考察了甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現甲醇的洗脫效果優(yōu)于乙腈，且各色譜峰分離效果更好，加入0.1%甲酸可以改善峰型，并提高質譜響應，故采用甲醇-0.1%甲酸水為流動相。由于本組方含有藥材較多，組方內所含成分比較復雜，因此選擇大梯度洗脫，以期最大程度地得到其中的化合物保留。質譜檢測比較了正、負離子兩種掃描模式，由于組方中所含多種化合物響應模式各有不同，因此，選擇正、負離子兩種掃描模式同時進行監(jiān)測。對于碎片電壓的選擇，本方中大部分化學成分在160 V 時以準分子離子峰形式穩(wěn)定存在，有少量化學成分在負離子模式下260V 時以準分子離子峰形式穩(wěn)定存在，圖譜本底較低，因此選擇160 V、260 V 的碎片電壓可以最大限度地對復方中的成分進行鑒別。

4 結論

本研究運用 HPLC-TOF/MS 技術快速鑒別夏枯草消瘤合劑中37 種化學成分，其中正離子模式碎片電壓160 V 條件下8 個；負離子模式碎片電壓160 V 條件下28 個，碎片電壓260 V 條件下19 個；正負離子均有響應4 個，負離子模式兩種碎片電壓下均有響應16 個，并對成分進行了藥材歸屬。該方法在傳統(tǒng)的植物化學分離提取基礎上對色譜峰進一步明確化，為夏枯草消瘤方的質量控制、體內的深入研究及臨床應用奠定了良好的基礎。

表 2 夏枯草消瘤合劑中化學成分的正離子模式鑒別結果

表 3 夏枯草消瘤合劑中化學成分的負離子模式鑒別結果