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        山慈菇通過PI3K/Akt信號通路影響乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖和凋亡①

        2020-04-13 06:48:50徐志峰宋易華
        中國免疫學雜志 2020年6期
        關(guān)鍵詞:山慈菇兔抗人提取液

        興 偉 劉 遠 徐 曌 徐志峰 宋易華

        (河北省中醫(yī)院外一科,石家莊 050000)

        乳腺癌是女性較為常見的惡性腫瘤之一,對女性患者的生命健康造成嚴重危害。中醫(yī)在我國治療惡性腫瘤方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗,多種中藥成分具有抗腫瘤作用。山慈菇藥性甘、微辛,具有解毒消腫、化痰散結(jié)的功效,在抑制新生血管生成和抗腫瘤方面也具有重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)山慈菇在胃癌、大腸癌、食管癌、肺癌等多種惡性腫瘤的治療中具有抗腫瘤作用,對乳腺癌細胞的生長也有抑制作用[2]。但山慈菇抑制乳腺癌細胞生長的機制尚不清楚。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路在多種惡性腫瘤的生長、耐藥、轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用,在乳腺癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲方面也發(fā)揮重要作用[3,4]。本文對山慈菇對乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、凋亡及PI3K/Akt信號通路的影響進行研究,探討山慈菇是否通過PI3K/Akt信號通路影響乳腺癌細胞的增殖和凋亡,現(xiàn)報告如下。

        1 材料與方法

        1.1材料 藥物:山慈菇(北京同仁堂藥店),乳腺癌MDA-MB-231細胞(中科院上海生命科學研究院細胞庫),胰島素生長因子1(IGF-1)、二甲基亞砜、噻唑藍(MTT)、膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素(Aneexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒、二奎啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(美國Sigma公司),RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、RIPA裂解液、化學發(fā)光(ECL)顯色液(美國Gibco公司),兔抗人活化的半胱天冬3(Cleaved-Caspase-3)多克隆抗體、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)多克隆抗體、兔抗人B-細胞淋巴瘤因子(Bcl-2)多克隆抗體、兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人磷酸化-PI3K(p-PI3K)多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、兔抗人p-Akt多克隆抗體、β-actin、羊抗兔二抗(美國Abclonal公司)等。

        1.2方法

        1.2.1山慈菇提取液制備 將山慈菇粉碎,用去離子水浸泡2 h,水煎法制備山慈菇提取液,提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮,制備山慈菇提取液濃度為1 g/ml,高壓滅菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2MTT法測定MDA-MB-231細胞增殖 將山慈菇提取液用培養(yǎng)基分別稀釋為0 mg/ml(只含培養(yǎng)基,不加山慈菇提取液)、5 mg/ml、10 mg/ml、 20 mg/ml、40 mg/ml、80 mg/ml。將MDA-MB-231細胞接種到6孔板上(濃度為1×105ml-1),每孔接種100 μl,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,加入上述各濃度的山慈菇提取液,每種濃度設(shè)7個復孔,培養(yǎng)24 h后加入MTT(5 mg/ml)15 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清液,加入二甲基亞砜孵育10 min,酶標儀測定波長490 nm處吸光度值(OD),計算細胞抑制率,細胞抑制率=(1-觀察組OD值/空白對照組OD值)×100%。計算山慈菇提取液的半數(shù)抑制濃度(IC50)為10.32 mg/ml,故取山慈菇提取液濃度為10 mg/ml進行后續(xù)實驗。按上述實驗方法測定加入10 mg/ml山慈菇培養(yǎng)0 h、24 h、72 h時MDA-MB-231細胞的增殖抑制率。

        1.2.3細胞分組和處理 將生長良好的MDA-MB-231細胞分為對照組(C組)、山慈菇組(CAM組)、胰島素生長因子1組(IGF-1組)、山慈菇+胰島素生長因子1組(CAM+IGF-1組)。C組不加藥物處理,CAM組加入10 mg/ml山慈菇處理,IGF-1組加入100 μg/L IGF-1處理,CAM+IGF-1組加入10 mg/ml山慈菇和100 μg/L IGF-1共處理。

        1.2.4MTT法測定各組細胞增殖 取上述各組生長良好的MDA-MB-231細胞,采用MTT法測定細胞OD值(方法同上),每組設(shè)7個復孔。

        1.2.5流式細胞儀測定細胞凋亡 取各組生長良好的MDA-MB-231細胞接種到6孔板中(濃度為1×105ml-1)培養(yǎng),每孔2 ml,第2天細胞貼壁生長后加入各組相應(yīng)的藥物處理,每組設(shè)7個復孔,培養(yǎng)24 h后收集各組細胞,移至離心管中,加入胰蛋白酶消化,顯微鏡下見細胞間隙變大、胞質(zhì)回縮、胞體變圓時快速吸除胰蛋白酶,加入培養(yǎng)液,離心(1 000 r/min)5 min,加入PBS液重懸細胞,離心(1 000 r/min)5 min,加入Annexin V-FITC液重懸細胞。對照組3管依次不加染料、單加Annexin V-FITC、單加碘化丙啶染色液;藥物組一次加入Annexin V-FITC,再加入PI染色液孵育20 min,采用流式細胞儀檢測各組MDA-MB-231細胞凋亡情況。

        1.2.6Hoechst 33258染色 在6孔板中加入細胞爬片蓋玻片,用RPMI1640培養(yǎng)基浸潤孔底,取各組對數(shù)生長的MDA-MB-231細胞接種到6孔板中(濃度為1×105ml-1),每孔2 ml,每組設(shè)7個復孔,待細胞下沉到孔底后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),顯微鏡下觀察細胞貼壁后吸除培養(yǎng)液,每組加入對應(yīng)的藥物處理,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),48 h后吸除培養(yǎng)液,加入固定液固定30 min,加入Hoechst 333258染色液孵育5 min,去除染色液,滴加抗熒光猝滅封片液,熒光顯微鏡下拍照并觀察細胞染色情況。細胞核飽滿,被染成均勻藍色為正常細胞;細胞核透亮固縮為凋亡細胞。

        1.2.7Western blot法測定細胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白及PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平 將各組MDA-MB-231細胞加入相應(yīng)藥物處理48 h 后,移至EP管中離心13 000 r/min離心1 min,將細胞沉淀中加入RIPA蛋白裂解液裂解30 min,提取總蛋白,采用BCA法測定各組MDA-MB-231細胞蛋白濃度。取25 μg蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,分別加入一抗:兔抗人Cleaved-Caspase-3多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人Bax多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人Bcl-2多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人PI3K多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人p-PI3K多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人Akt多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人p-Akt多克隆抗體(1∶1 000),以β-actin(1∶1 000)為內(nèi)參照,過夜孵育,加入羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育2 h,加入ECL顯影,用ImageQuant LAS 4000曝光成像,采用BandScan圖像分析軟件分析條帶灰度值,目標蛋白水平以目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

        2 結(jié)果

        2.1山慈菇提取液對MDA-MB-231細胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示,作用24 h時,山慈菇提取液濃度為0 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、 20 mg/ml、40 mg/ml、80 mg/ml時MDA-MB-231細胞的增殖抑制率先上升后下降,山慈菇提取液濃度在0~20 mg/ml 時細胞增殖抑制率隨濃度增加而增加,濃度在20~80 mg/ml時細胞增殖抑制率隨濃度增加而降低;濃度為20 mg/ml時細胞增殖抑制率最高,見圖1。經(jīng)計算山慈菇提取液的半數(shù)抑制濃度(IC50)為10.32 mg/ml,故取山慈菇提取液濃度為10 mg/ml進行后續(xù)實驗。

        濃度為10 mg/ml時,山慈菇提取液對MDA-MB-231細胞增殖抑制率的影響隨時間增加而增加,見圖2。

        2.2各組MDA-MB-231細胞增殖比較 各組MDA-MB-231細胞增殖比較差異有統(tǒng)計學意義(F=4.254,P=0.015),與C組(0.38±0.12)比較,CAM組MDA-MB-231細胞OD值(0.21±0.09)降低(P<0.05),與CAM組比較,CAM+IGF-1組MDA-MB-231細胞OD值(0.35±0.11)升高(P<0.05),IGF-1組MDA-MB-231細胞OD值(0.41±0.13)與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖3。

        2.3各組MDA-MB-231細胞凋亡率比較 各組MDA-MB-231細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=190.965,P=0.000), 與C組[(7.26±1.42)%]比較,CAM組MDA-MB-231細胞凋亡率[(21.54±2.31)%]升高(P<0.05),與CAM組比較,CAM+IGF-1組MDA-MB-231細胞凋亡率[(8.32±0.21)%]降低(P<0.05),IGF-1組MDA-MB-231細胞凋亡率[(6.57±0.16)%]與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖4和圖5。

        圖1 不同濃度山慈菇提取液對MDA-MB-231細胞增殖抑制率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of cremastra appendiculata makino on MDA-MB-231 cell proliferation inhibition rate

        圖2 不同時間山慈菇提取液對MDA-MB-231細胞增殖抑制率的影響Fig.2 Effect of cremastra appendiculata makino on MDA-MB-231 cell proliferation inhibition rate at different times

        圖3 各組MDA-MB-231細胞OD值Fig.3 OD values of each group of MDA-MB-231 cells

        2.4各組MDA-MB-231細胞Hoechst染色比較 C組細胞核飽滿,被染成均勻的藍色;CAM組細胞數(shù)量減少,細胞核透亮固縮; IGF-1組和CAM+IGF-1組細胞核染色和對照組差別不大。各組MDA-MB-231細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=66.201,P=0.000),與C組[(12.51±4.47)%]比較,CAM組MDA-MB-231細胞凋亡率[(43.23±5.14)%]升高(P<0.05),與CAM組比較,CAM+IGF-1組MDA-MB-231細胞凋亡率[(14.43±5.48)%]降低(P<0.05),IGF-1組MDA-MB-231細胞凋亡率[(10.26±5.03)%]與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖6、7。

        圖4 流式細胞儀測定各組MDA-MB-231細胞凋亡Fig.4 Flow cytometry for determination of apoptosis in each group of MDA-MB-231 cells

        圖5 流式細胞儀測定各組MDA-MB-231細胞凋亡率Fig.5 Flow cytometry to determine apoptosis rate of each group of MDA-MB-231 cells

        圖6 各組MDA-MB-231細胞Hoechst染色(×400)Fig.6 Hoechst staining of each group of MDA-MB-231 cells (×400)

        2.5各組細胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白水平比較 與C組比較,CAM組MDA-MB-231細胞Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05);與CAM組比較,CAM+IGF-1組MDA-MB-231細胞Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05),見表1和圖8。

        圖7 Hoechst染色測定各組MDA-MB-231細胞凋亡率Fig.7 Hoechst staining for determination of apoptotic rate in each group of MDA-MB-231 cells

        GroupsCleaved-Caspase-3BaxBcl-2C group0.32±0.070.26±0.050.51±0.08CAM group0.45±0.061)0.42±0.071)0.09±0.041)IGF-1 group0.33±0.080.24±0.050.50±0.09CAM+IGF-1 group0.31±0.072)0.27±0.062)0.47±0.112)F6.06914.15640.668P0.0030.0000.000

        Note:Compared with the C group,1)P<0.05;compared with the CAM group,2)P<0.05.

        圖8 各組細胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白Western blot電泳圖Fig.8 Western blot analysis of Cleaved-Caspase-3,Bax and Bcl-2 proteins in each group of cellsNote: 1.C group;2.CAM group;3.IGF-1 group;4.CAM+IGF-1 group.

        GroupsPI3Kp-PI3KAktp-AktC group0.54±0.120.52±0.130.39±0.160.26±0.08CAM group0.56±0.130.14±0.091)0.43±0.170.11±0.051)IGF-1 group0.51±0.110.73±0.150.42±0.150.37±0.06CAM+IGF-1 group0.53±0.140.47±0.142)0.40±0.160.23±0.092)F0.19324.8840.09115.529P0.9000.0000.9640.000

        Note:Compared with the C group,1)P<0.05;compared with the CAM group,2)P<0.05.

        圖9 各組細胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白Western blot電泳圖Fig.9 Western blot analysis of PI3K,p-PI3K,Akt and p-Akt proteins in each group of cellsNote: 1.C group;2.CAM group;3.IGF-1 group;4.CAM+IGF-1 group.

        2.6各組細胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平比較 各組MDA-MB-231細胞PI3K、Akt蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),各組MDA-MB-231細胞p-PI3K、p-Akt蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中與C組比較,CAM組p-PI3K、p-Akt蛋白水平降低(P<0.05);與CAM組比較,CAM+IGF-1組p-PI3K、p-Akt蛋白水平升高(P<0.05),見表2和圖9。

        3 討論

        山慈菇是蘭科植物杜鵑蘭、獨蒜蘭、云南獨蒜蘭的干燥假鱗莖,杜鵑蘭是山慈菇的主流品種,在臨床抗腫瘤方面具有良好效果[5]。山慈菇抗腫瘤的機制包括:山慈菇的某些化學成分可直接殺傷腫瘤細胞,具有細胞毒作用;山慈菇中含有的多糖成分可改變惡性腫瘤細胞的細胞膜生長特性、抑制惡性腫瘤細胞的生長周期,從而抑制惡性腫瘤細胞的增殖,發(fā)揮抗腫瘤作用;山慈菇可通過誘導惡性腫瘤細胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用;山慈菇可通過降解細胞外基質(zhì)和基底膜抑制惡性腫瘤細胞侵襲和遷移;山慈菇可通過抑制腫瘤新生血管生成抑制腫瘤生長[6,7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)山慈菇對乳腺癌細胞的生長具有抑制作用,如牛曉雨等[8]研究發(fā)現(xiàn)山慈菇水煎劑可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖,將細胞周期阻滯在G2期,并可促進乳腺癌細胞凋亡,有效抑制乳腺癌細胞遷移。本文研究發(fā)現(xiàn)山慈菇提取液可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖,其對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用隨劑量的增加先升高后下降,分析可能為:山慈菇提取液的過量應(yīng)用,對乳腺癌細胞增殖的抑制作用反而減弱,其具體機制有待進一步研究;而在安全劑量范圍內(nèi),山慈菇提取液對乳腺癌細胞增殖的抑制作用隨劑量增加而增加,具有一定劑量依賴性。根據(jù)山慈菇提取液的IC50為10.32 mg/ml,取山慈菇提取液濃度為10 mg/ml 進行研究,發(fā)現(xiàn)山慈菇提取液可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡。

        細胞凋亡是一種主動發(fā)生的程序性死亡,由基因介導產(chǎn)生;細胞凋亡除了在正常生理過程中發(fā)生外,在惡性腫瘤等多種疾病中也存在細胞凋亡現(xiàn)象,細胞凋亡減少而細胞增殖過度則引起惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。惡性腫瘤的發(fā)生和惡性腫瘤細胞的增殖失控和凋亡減少關(guān)系密切,多種抗凋亡細胞因子和促凋亡細胞因子在細胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用;凋亡是由多種基因嚴格控制的,主要包括癌基因C-myc、抑癌基因P53以及Caspase家族和Bcl-2家族[10]。Caspase家族的凋亡途徑包括線粒體介導的內(nèi)源性途徑和死亡受體介導的外源性凋亡途徑[11]。Bcl-2家族和線粒體介導的內(nèi)源性凋亡途徑關(guān)系密切;在DNA損傷等內(nèi)部信號刺激下,細胞漿Bcl-2家族成員聚集到線粒體,在抗凋亡因子和促凋亡因子的作用下,調(diào)節(jié)釋放細胞色素C,細胞色素C在胞漿中和凋亡因子結(jié)合形成多聚體,引起Caspase-9活化,激活的Caspase激活其下游的Caspase-3,引起細胞凋亡的發(fā)生;作為抑制凋亡基因的Bcl-2在生長因子受體的介導中發(fā)揮作用,通過抑制細胞凋亡參與惡性腫瘤的發(fā)病[12]。Bax則與Bcl-2相反,可促進細胞凋亡;Bcl-2過表達和Bax形成二聚體,抑制細胞凋亡,Bax過表達可形成同源二聚體誘導細胞凋亡[13]。山慈菇可通過影響Caspase-3、Bax、Bcl-2表達發(fā)揮抗腫瘤作用,如于林楠等[14]研究發(fā)現(xiàn)山慈菇提取物可通過提高Caspase-3、Bax表達以及降低Bcl-2表達抑制結(jié)腸癌HT29細胞增殖,誘導結(jié)腸癌細胞凋亡,發(fā)揮抗結(jié)腸癌的作用。

        PI3K/Akt信號通路在多種生命發(fā)揮中發(fā)揮關(guān)鍵性作用,在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮關(guān)鍵信號通路的作用[15,16];研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、化療耐藥、侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要作用[17,18]。多種因素可調(diào)控PI3K/Akt信號通路的激活,活化的PI3K(即磷酸化的PI3K)可激活其下游的AKT,激活的AKT通過磷酸化可促進其下游的抗凋亡基因Bcl-2的表達,抑制Caspase-3、Bax的表達,從而發(fā)揮抗凋亡的作用[19,20]。

        多種中藥成分可通過PI3K/Akt信號通路影響乳腺癌細胞的生長,如韋立群等[21]研究發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮可通過抑制PI3K/Akt信號通路下調(diào)Bcl-2的表達,促進Caspase-3和Bax的表達抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞生長并誘導其凋亡;劉楠等[22]研究發(fā)現(xiàn)紅花多糖通過阻斷PI3K/Akt通路誘導乳腺癌細胞MDA-MB-435的凋亡。介于上述研究,推測山慈菇可能通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制乳腺癌細胞生長,本文對該推測進行研究,發(fā)現(xiàn)山慈菇可升高乳腺癌MDA-MB-231細胞中Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白水平,降低Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白水平。IGF-1可以通過PI3K磷酸化而被激活,激活的PI3K引起其下游的AKT磷酸化而被活化,因此IGF-1為常用的PI3K/Akt信號通路激動劑。本文采用IGF-1和山慈菇共同作用于乳腺癌MDA-MB-435細胞,發(fā)現(xiàn)IGF-1可抵消山慈菇對乳腺癌MDA-MB-435細胞增殖、凋亡及Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白水平的影響。由此表明山慈菇可能通過抑制PI3K/Akt信號通路影響其下游抑癌基因Bax和促癌基因Bcl-2、Caspase-3的表達,從而促進乳腺癌細胞增殖,誘導其凋亡。

        綜上所述,山慈菇可能通過PI3K/Akt信號通路影響其下游的促凋亡及抗凋亡基因的表達促進乳腺癌細胞增殖、抑制乳腺癌細胞凋亡。

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