王玲仙 王波 陳越 付堅(jiān) 鐘巧芳 陳玲 丁明亮 趙才美 雷涌濤 程在全*

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650205；2 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，昆明650205；3 云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650091；第一作者：2913380597@qq.com；*通訊作者：czquan-99@163.com）

藥用野生稻（Oryza officinalis Wall. ex watt）為多年生禾本科植物，長期處于野生狀態(tài)，經(jīng)受各種災(zāi)害和地理生態(tài)因素的作用，形成了各種抗性和耐受不良環(huán)境等優(yōu)異性狀，是天然的基因庫[1]，具有大穗、寬葉片、粗莖稈等農(nóng)藝性狀，為普通水稻遺傳改良提供了重要物質(zhì)基礎(chǔ)。植物愈傷誘導(dǎo)與分化受到多種因素的影響，如：基因型、外植體選擇、培養(yǎng)基類型以及它們之間的互作[2]。盡快發(fā)掘和利用有利基因，必須建立野生稻高效快繁綠苗培養(yǎng)體系，過去不同學(xué)者對(duì)野生稻提高綠苗分化率方法上曾做過一些研究[3-5]。本文利用藥用野生稻幼穗，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，多組合激素配比篩選出愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基。短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)遺傳背景一致的藥用野生稻材料規(guī)?；a(chǎn)，滿足以大量藥用野生稻為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行抗性基因和新種質(zhì)育種研究的需要，為品種資源保存和育種苗提供足夠保障。

1 材料與方法

1.1 樣品材料

1.1.1 樣品來源和采集

樣品來源于云南省孟定縣，采集當(dāng)年藥用野生稻第二次枝梗原基和穎花原基分化期的幼穗。

1.1.2 幼穗前處理和滅菌處理

將采集的幼穗用保鮮膜包裹好，置于4℃冰箱保鮮層中，低溫前處理3～5 d 后將幼穗取出，用70%酒精表面滅菌1 min，再用0.1%的氯化汞滅菌12 min，無菌水清洗6～7 遍，吸水紙吸干多余水分，待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 幼穗接種預(yù)培養(yǎng)

將幼穗剝出，接入不添加激素培養(yǎng)基上進(jìn)行幼穗預(yù)培養(yǎng)，20～35 d 后幼穗萌動(dòng)出現(xiàn)透明白點(diǎn)，到透明白點(diǎn)增多，待轉(zhuǎn)接。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

將增多的透明白點(diǎn)轉(zhuǎn)接到2,4-D 濃度為1.0～10.0 mg/L 的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)，每組接種30～35 個(gè)萌發(fā)白點(diǎn)，35 d 后，愈傷呈透明顆粒狀，待轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

1.2.3 愈傷組織增殖培養(yǎng)

當(dāng)愈傷長成膨松透明顆粒時(shí)，轉(zhuǎn)接到2,4-D 濃度為4.0 mg/L 增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行60 d 增殖培養(yǎng)，30 d 更換1 次培養(yǎng)基，增殖愈傷數(shù)量增多時(shí)，待轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2.4 愈傷繼代培養(yǎng)

將數(shù)量增多的增殖愈傷轉(zhuǎn)接到2,4-D 濃度為2.0 mg/L 中進(jìn)行繼代培養(yǎng)3 次，每30 d 換1 次培養(yǎng)基，直到長出小芽，待轉(zhuǎn)接進(jìn)行分化培養(yǎng)；愈傷預(yù)培養(yǎng)、誘導(dǎo)、增殖和繼代培養(yǎng)，添加培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基為：N6、植物凝膠2.8 g/L、蔗糖30.0 g/L、pH 值5.8；愈傷誘導(dǎo)、增殖和繼代培養(yǎng)條件為：28℃的人工氣候箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)。幼穗接種預(yù)培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度3 000 lx 培養(yǎng)20 d，再下調(diào)至1 000 lx 培養(yǎng)35 d。

表1 不同2,4-D 濃度條件下誘導(dǎo)愈傷組織的生長情況

1.2.5 愈傷組織分化成小苗

將愈傷長出的小芽接入6-BA 濃度為0.1～3.0 mg/L 分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，每組接種30～35 個(gè)，30 d后，轉(zhuǎn)接到6-BA 濃度為0.5 mg/L 增殖培養(yǎng)基和6-BA濃度為0.2 mg/L 的繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖和繼代各培養(yǎng)30 d、60 d 后，長出小苗進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。

1.2.6 分化壯苗培養(yǎng)

將繼代小苗接種在6-BA 濃度為0.3 mg/L 的壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)32 d，小苗長至3～4 cm 時(shí)，莖稈增粗，葉色油綠，進(jìn)行生根培養(yǎng)。分化、增殖、繼代、壯苗培養(yǎng)基添加激素和培養(yǎng)基為：N6、NAA 0.3 mg/L、ZT 2.0 mg/L、KT 3.0 mg/L；壯苗培養(yǎng)基另外添加TDZ 3.0 mg/L；添加培養(yǎng)材料為：植物凝膠2.8 g/L、蔗糖30 g/L，pH 值5.8；培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度28℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.2.7 生根培養(yǎng)

將3～4 cm 的壯苗分別接在1/2 N6、NAA 濃度為0.1～2.0 mg/L 的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，每組接種10～16 苗，15 d 后，根芽露白、根芽長出，28～36 d 統(tǒng)計(jì)主根、須根長、根粗和根數(shù)，觀察植株生長情況。當(dāng)生根苗長至7～10 cm 時(shí)進(jìn)行苗鍛煉培養(yǎng)。

1.2.8 苗鍛煉培養(yǎng)

將長至7～10 cm 的生根苗揭膜加水培養(yǎng)，3 d 后將苗從培養(yǎng)基中取出，自來水沖洗干凈根部培養(yǎng)基后加水淹沒根部。

生根添加培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基為：1/2 N6、植物凝膠2.8 g/L、蔗糖15.0 g /L，pH 值5.8；培養(yǎng)條件為：生根和苗鍛煉培養(yǎng)溫度28 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.2.9 苗的溫室定植

苗鍛煉培養(yǎng)7 d，將苗從培養(yǎng)箱中取出，單苗移栽在裝有珍珠巖、泥炭、蛭石（按3∶2∶1 比例混勻）的盆中進(jìn)行定植生長，水淹沒根部，培養(yǎng)1 周后，將水放干，定根生長7 d，再加水進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.10 苗的田間移栽和管理

定根苗定植生長40 d 后，將苗移栽到大田，注意有效固根，中期保證水、保肥，注意病蟲害的防治，生長中后期進(jìn)行追施尿素肥1 次，直到種子成熟。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼穗前處理和幼穗接種預(yù)培養(yǎng)

幼穗經(jīng)過4℃低溫前處理3～5 d，利于幼穗萌發(fā)。剝離的幼穗接入零培養(yǎng)基上，先強(qiáng)光，再弱關(guān)進(jìn)行幼穗預(yù)培養(yǎng)，20 d 后幼穗萌動(dòng)出現(xiàn)透明白點(diǎn)，繼續(xù)培養(yǎng)35 d，透明白點(diǎn)增多，有少許白點(diǎn)增大。

2.2 不同2,4-D 濃度對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響

由表1 可見，設(shè)置10 個(gè)組合不同濃度激素的N6愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，35 d 后，愈傷呈透明顆粒狀，在愈傷組織上出現(xiàn)粒狀結(jié)構(gòu)的胚狀體，與舒理慧等[6]報(bào)道類似，此時(shí)2,4-D 濃度為2.0 mg/L 的培養(yǎng)基愈傷誘導(dǎo)出愈率最高，達(dá)100%（圖1）。接入2,4-D 濃度為4.0 mg/L的培養(yǎng)基愈傷，經(jīng)過60 d 的增殖培養(yǎng)，愈傷顆粒膨大，愈傷數(shù)量增多，出愈率在96.7%。增殖愈傷在2,4-D 濃度為3.0 mg/L 的培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)90 d，愈傷長至1.5～2.0 cm，愈傷透明、膨松，顏色由原來黃綠色變成深綠緊實(shí)顆粒愈傷。當(dāng)2,4-D 濃度為12.0 mg/L 時(shí)，愈傷出愈最差，只達(dá)到18.8%，褐化嚴(yán)重。

表2 不同6-BA 濃度條件下再生苗的分化生長情況

圖1 藥用野生稻愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)

圖2 藥用野生稻分化培養(yǎng)

2.3 不同6-BA 濃度對(duì)再生苗分化生長的影響

設(shè)置10 個(gè)組合不同濃度激素的N6 分化培養(yǎng)基，經(jīng)過90 d 的分化、增殖和繼代培養(yǎng)，從表2 可以看出，愈傷在濃度為6-BA 0.1～1.0 mg/L 的分化培養(yǎng)基中都能夠分化出苗，成苗率在3.0%～22.9%之間，最佳的分化培養(yǎng)基濃度為6-BA 0.4 mg/L，成苗率達(dá)到22.9 %（圖2）；其次濃度為6-BA 0.5 mg/L 時(shí)，成苗率達(dá)到15.6%，叢芽增多，此培養(yǎng)基作增殖培養(yǎng)最好。當(dāng)濃度為6-BA 1.0 mg/L 時(shí)，成苗率低，只達(dá)到3.0%；小苗生長緩慢、無循環(huán)叢芽長出，用于保種、繼代培養(yǎng)最適宜；以濃度為6-BA 0.3 mg/L 添加TDZ 3.0 mg/L 作為壯苗培養(yǎng)較好，經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的小苗健壯，油綠。在濃度為6-BA 2.0～3.0 mg/L 的培養(yǎng)基中未分化出綠苗。從10 個(gè)組合培養(yǎng)基來看都產(chǎn)生白化苗，最高的白化苗占接種數(shù)的25.7%。污染數(shù)最高占接種數(shù)的17.1%。

2.4 不同NAA 濃度對(duì)生根苗生長的影響

設(shè)置10 個(gè)組合不同濃度激素的1/2 N6 生根培養(yǎng)基，從表3 可以看出，當(dāng)NAA 的濃度為0.1～0.2 mg/L時(shí)，藥用野生稻幼穗的平均主根長及生根率均隨著激素的增高而增高，主根、須根增粗；NAA 濃度在0.2 mg/L 時(shí)，須根最多，生根率最高，達(dá)到90.9%（圖3）；當(dāng)NAA 的濃度為0.3～0.9 mg/L 時(shí)，藥用野生稻幼穗的生根率隨著激素濃度的增高而逐漸下降，平均主根長也隨之降低，平均根粗和須根數(shù)量無規(guī)律變化，須根根系分蘗強(qiáng)，根系發(fā)達(dá)；當(dāng)NAA 的濃度為1.0 mg/L 時(shí)，生根率最差，只達(dá)到7.1%，平均根長最短、根粗最細(xì)。

2.5 苗鍛煉及移栽管理

組培苗和自然生長苗生存環(huán)境存在著很大差異，組培苗由室內(nèi)環(huán)境逐漸過渡到室外，生長環(huán)境由無菌狀態(tài)變成有菌狀態(tài)，培養(yǎng)溫度和光照條件同樣發(fā)生了改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生根苗從揭膜、適應(yīng)常溫、溫室定植到田間移栽，經(jīng)歷57 d 循序漸進(jìn)的過程，苗的成活率達(dá)到97.0%。

3 討論

3.1 2,4-D 濃度對(duì)藥用野生稻幼穗愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在藥用野生稻幼穗離體培養(yǎng)中，形成愈傷組織和胚性愈傷組織是離體培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)。植物生長素是影響水稻愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素之一，2,4-D 是誘導(dǎo)水稻組織產(chǎn)生愈傷組織不可缺少的關(guān)鍵激素成分[7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幼穗接種預(yù)培養(yǎng)后，透明白點(diǎn)增多，應(yīng)盡快接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)。當(dāng)2,4-D 濃度＜1.0 mg/L 或＞6.0 mg/L 時(shí)都不利于藥用野生稻幼穗愈傷和胚性愈傷組織的形成。在幼穗的不同發(fā)育時(shí)期，都有著不同的生理狀態(tài)與形態(tài)發(fā)生規(guī)律，其愈傷組織誘導(dǎo)率都會(huì)存在一定的差異[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)愈傷時(shí)，愈傷大約0.3 cm 時(shí)會(huì)長出細(xì)根，說明野生稻根系是比較發(fā)達(dá)的，愈傷繼代幾次必須觀察愈傷由透明膨松愈傷變成黃綠凸起的緊實(shí)顆粒愈傷，此時(shí)愈傷用于分化最佳。

表3 不同激素濃度對(duì)生根苗的生長情況

圖3 藥用野生稻生根培養(yǎng)

3.2 生長調(diào)節(jié)劑對(duì)緊穗野生稻幼穗分化成苗的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑是影響愈傷組織再分化的關(guān)鍵性因素之一，細(xì)胞分裂素在組織培養(yǎng)中促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，可促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂和不定芽的形成，打破頂端優(yōu)勢(shì)形成叢生芽，有利于芽的增殖和繼代培養(yǎng)[10-12]。6-BA 是誘導(dǎo)水稻愈傷組織再生植株時(shí)常用的細(xì)胞分裂素[13]。周玲艷等[14-15]認(rèn)為，6-BA 有利于水稻愈傷組織的分化，選擇生長素NAA 與一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生，也是相符合的[16]。在分化培養(yǎng)基中添加KT、ZT 促進(jìn)成苗而不利于分化[17]。本實(shí)驗(yàn)中，與6-BA 搭配使用，芽分化增多，苗分化率明顯得到提高。人們發(fā)現(xiàn)TDZ 在芽分化、愈傷組織誘導(dǎo)、體胚發(fā)生、生根等方面都表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性[18]。在藥用野生稻分化壯苗培養(yǎng)基中添加TDZ，并與多激素配比，也有利于分化率的提高和壯苗培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)得出，利用生長素和幾種細(xì)胞分裂素適合的比例聯(lián)合使用，促進(jìn)了愈傷綠色凸起增多、叢生芽和新愈傷長出，成苗率得到提高，是藥用野生稻幼穗分化的最佳選擇。不同品種材料在選擇培養(yǎng)基及激素搭配和比例配比時(shí)，必須對(duì)癥下藥，方可見效，以免適得其反。

3.3 生長調(diào)節(jié)劑對(duì)緊穗野生稻幼穗生根苗的影響

眾所周知，生長素NAA 其主要作用是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根。NAA 濃度0.2 mg/L 時(shí)，是最佳的生根培養(yǎng)基，生根率達(dá)到90.9%。促進(jìn)了主根的增長，增多須根，須根分枝強(qiáng)，有利于根系吸收水分和養(yǎng)分。

3.4 苗鍛煉及移栽管理

苗的鍛煉及大田移栽，從揭膜、放置常溫、溫室定植到田間移栽經(jīng)歷57 d 這樣一個(gè)循序漸進(jìn)的過程，苗的成活率可以達(dá)到97.0%。

4 結(jié)論

本研究對(duì)藥用野生稻幼穗離體培養(yǎng)、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方法進(jìn)行了有效改進(jìn)；根據(jù)不同的生長需要，篩選出適合藥用野生稻幼穗愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基。4℃低溫前處理和幼穗預(yù)培養(yǎng)有利于白點(diǎn)萌發(fā)的增多和增大，更利于愈傷的出愈率，優(yōu)質(zhì)的愈傷提高了藥用野生稻幼穗的分化率，高質(zhì)量的分化率又獲得了健壯的藥用野生稻幼穗生根苗，實(shí)現(xiàn)了建立藥用野生稻幼穗離體保存庫關(guān)鍵技術(shù)的突破。