袁振亞， 王明華， 翁陽(yáng)△

1海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科(海南?？?570100)； 2海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科(海南?？?570100)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，約占所有NHL的30%～40%，是一組異質(zhì)性明顯的侵襲性淋巴瘤，臨床病情進(jìn)展迅速，預(yù)后較差，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。據(jù)報(bào)道DLBCL患者5年總體生存率僅為46%[1]。激活轉(zhuǎn)錄因子2(ATF-2)屬于ATF/CREB(cAMP response element binding protein)轉(zhuǎn)錄因子家族，是激活蛋白1(AP1)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物不可或缺的組成成分[2]。研究表明ATF-2在惡性黑色素瘤、食管癌、肺癌、肝癌、腎癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮一定致癌作用[3-7]，也有報(bào)道證實(shí)ATF-2基因在DLBCL細(xì)胞株BJAB、SUDHL-4、HBL-1、OCI-LY3中高表達(dá)，當(dāng)抑制ATF-2基因表達(dá)時(shí)，這些細(xì)胞株的生長(zhǎng)受到抑制[8]。但ATF-2蛋白在非特指型彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL，NOS)與淋巴結(jié)反應(yīng)性增生(RH)病例中的表達(dá)情況及表達(dá)差異，以及ATF-2蛋白表達(dá)與DLBCL，NOS的臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系鮮有報(bào)道。因此本研究旨在探討ATF-2蛋白在DLBCL，NOS中的表達(dá)意義，分析其表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系，為DLBCL，NOS的發(fā)病機(jī)制及診療策略提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2013年1月至2018年6月60例DLBCL，NOS病例和40例淋巴結(jié)RH病例，從醫(yī)院數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取患者的年齡、性別等臨床數(shù)據(jù)。60例DLBCL，NOS病例中，男33例，女27例，年齡23～88歲，平均(61±16.22)歲。40例淋巴結(jié)RH病例中，男21例，女19例，年齡5～78歲，平均(44.6±18.33)歲。所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)4%的中性甲醛固定及石蠟包埋，組織蠟塊采用4 μm連續(xù)切片，術(shù)后病理診斷明確。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 4 μm石蠟切片脫蠟，梯度乙醇水化，去離子水2次(1 min/次)，雙氧水5 min，流水沖洗5 min，EDTA熱修復(fù)24 min，采用MAX Vision二步法進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。ATF-2兔抗人單克隆抗體為美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，選用已知子宮內(nèi)膜樣腺癌陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS取代一抗作為陰性對(duì)照，稀釋比例1∶100。CyclinD1、BCL-2、CD10、BCL-6及MUM1抗體均為福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品，為即用型抗體。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀 ATF-2以腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色染色為陽(yáng)性，BCL-2、CD10以腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色染色為陽(yáng)性，CyclinD1、BCL-6、MUM1以腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核呈棕褐色染色為陽(yáng)性。在顯微鏡低倍(10×)視野下瀏覽整張切片，選擇目標(biāo)細(xì)胞高表達(dá)區(qū)域，隨機(jī)對(duì)5個(gè)高倍(40×)視野進(jìn)行判讀，根據(jù)著色程度及陽(yáng)性細(xì)胞所占比例用組織學(xué)評(píng)分(∑Pi)計(jì)算積分，取平均值。其中i代表細(xì)胞染色深淺，包括0分：不顯色或顯色不清；1分：淺黃色；2分：棕黃色；3分：深褐色。P代表將陽(yáng)性細(xì)胞的百分率數(shù)值進(jìn)行半定量分級(jí)：<5% 為0分；5%～24%為1分；25%～49%為2分；50%～74%為3分；≥75%為4分。所得積分≤7分，記為低表達(dá)；>7分，記為高表達(dá)。

1.4 隨訪 生存時(shí)間以疾病確診之日算起至死亡日期或至末次隨訪日期，隨訪截止日期為2018年12月1日，以電話隨訪為主。到隨訪截止日期為止，60例DLBCL，NOS患者中死亡病例為14例，生存時(shí)間為1～47個(gè)月，平均生存時(shí)間為10.43個(gè)月。存活病例為26例。另外20例失訪。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，顯著性分析采用四格表Chi-Square檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATF-2蛋白在DLBCL，NOS和淋巴結(jié)RH病例中的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示：兩組病例中ATF-2蛋白均表現(xiàn)為目標(biāo)細(xì)胞細(xì)胞核著色，不同病例細(xì)胞染色程度強(qiáng)弱不等，見(jiàn)圖1。ATF-2蛋白在DLBCL，NOS組織中的表達(dá)明顯高于在淋巴結(jié)RH組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，見(jiàn)表1。

2.2 ATF-2蛋白表達(dá)與DLBCL，NOS年齡、性別的關(guān)系 ATF-2蛋白在DLBCL，NOS不同年齡、性別分組之間表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 ATF-2蛋白表達(dá)與DLBCL，NOSHans分型的關(guān)系 ATF-2蛋白在DLBCL，NOS不同Hans分型分組之間表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3～4。

2.4 ATF-2蛋白的表達(dá)與BCL-2蛋白及CyclinD1蛋白表達(dá)的關(guān)系 DLBCL，NOS組織中ATF-2蛋白表達(dá)與BCL-2蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)(P=0.595)，見(jiàn)表5。60例DLBCL，NOS組織中Cyclin D1蛋白均無(wú)表達(dá)。

2.5 ATF-2蛋白表達(dá)與DLBCL，NOS患者預(yù)后關(guān)系 45例ATF-2蛋白高表達(dá)的DLBCL，NOS病例隨訪至2018年12月1日，16例失訪，21例健在，8例死亡，15例ATF-2蛋白低表達(dá)病例隨訪至2018年12月1日，4例失訪，5例健在，6例死亡。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：ATF-2蛋白高表達(dá)的DLBCL，NOS患者與低表達(dá)的DLBCL，NOS患者總生存期的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.194)。見(jiàn)表6、圖2。

注：A:ATF-2蛋白在DLBCL，NOS中高表達(dá)；B:ATF-2蛋白在淋巴結(jié)RH中高表達(dá);C:ATF-2蛋白在DLBCL，NOS中低表達(dá)；D:ATF-2蛋白在淋巴結(jié)RH中低表達(dá)

圖1ATF-2蛋白在DLBCL，NOS組織與淋巴結(jié)RH組織中的表達(dá)(MAXvision法免疫組化，×40)

表1ATF-2蛋白在DLBCL，NOS組織與淋巴結(jié)RH組織中的表達(dá) 例

表2ATF-2蛋白的表達(dá)與DLBCL，NOS年齡、性別的關(guān)系 例(%)

表3DLBCL，NOS中CD10、BCL-6、MUM1蛋白的表達(dá)情況

表4ATF-2蛋白的表達(dá)與DLBCL，NOS Hans分型的關(guān)系例(%)

表5ATF-2蛋白表達(dá)與BCL-2蛋白表達(dá)的關(guān)系例(%)

3 討論

ATF-2又名m-XBP、CRE-BP1，位于人類(lèi)染色體2q32，全長(zhǎng)約為2.1 kb，共包含有505個(gè)氨基酸，是真核基因生物體內(nèi)獨(dú)有并且廣泛存在的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，屬于ATF/cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)家族。該家族包含有16個(gè)轉(zhuǎn)錄因子成員，其共同特征為包含有一段由5′-TGACGTCA-3′堿基序列構(gòu)成的cAMP應(yīng)答元件(CRE)，也都具有堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域，是bZIP蛋白家族中一個(gè)較大的群體[4-5，7，9]。

表6ATF-2蛋白表達(dá)與DLBCL，NOS患者預(yù)后關(guān)系

圖2ATF-2蛋白表達(dá)與DLBCL，NOS患者預(yù)后的關(guān)系

ATF-2具有轉(zhuǎn)錄因子、DNA損傷應(yīng)答蛋白、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)等多重活性，各種活性之間相互配合協(xié)調(diào)以調(diào)控機(jī)體正常細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[10-11]。ATF-2基因編碼的蛋白質(zhì)在不同類(lèi)型組織及細(xì)胞中的表達(dá)定位不盡相同，定位于細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)。ATF-2具有致癌和抑癌雙重功能，其中與其致癌功能緊密相關(guān)的特性為細(xì)胞核內(nèi)定位及轉(zhuǎn)錄因子活性[3，12]。其中細(xì)胞核內(nèi)定位受蛋白激酶PKCε的調(diào)控，PKCε可以直接磷酸化ATF-2的T52位點(diǎn)，維持ATF-2的核內(nèi)定位，使其可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性[12]。當(dāng)受到各種由病原感染、精神壓力、環(huán)境應(yīng)激等產(chǎn)生的炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子以及缺氧、代謝釋放的活性氧類(lèi)等的刺激時(shí)，絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)JNK/p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活[5，13]，直接磷酸化ATF-2氨基端的Thr69和Thr71殘基[14-15]，磷酸化的ATF-2通過(guò)bZIP與其他bZIP蛋白發(fā)生異二聚化從而獲得轉(zhuǎn)錄因子活性，繼而與下游靶基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的特定DNA序列結(jié)合，參與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控[16-17]。能夠與ATF-2形成異二聚體的蛋白分子包括ATF/CREB家族成員，Jun家族成員，F(xiàn)os家族成員。其中ATF-2-c-Jun二聚體是和腫瘤發(fā)生最密切相關(guān)的二聚化形式[4]。

早期報(bào)道表明，在惡性黑色素瘤中，ATF-2定位在細(xì)胞核內(nèi)，并與c-Jun形成異二聚體，通過(guò)激活細(xì)胞周期蛋白D1基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，當(dāng)抑制ATF-2轉(zhuǎn)錄活性時(shí)可以抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖[18-19]，同時(shí)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性[20]。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞中，ATF-2被蛋白激酶JNK直接磷酸化，與c-Jun形成異二聚體，并與下游靶基因CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)的CRE元件結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。前列腺癌細(xì)胞中，ATF-2被JNK/p38激活，作用于靶基因2OST啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控2OST的表達(dá)，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，加速前列腺癌進(jìn)展過(guò)程。肝癌細(xì)胞內(nèi)，ATF-2呈現(xiàn)細(xì)胞核高表達(dá)，通過(guò)MAPK/ERK途徑被激活，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。相對(duì)于正常肺細(xì)胞和組織，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和組織中，ATF-2基因表達(dá)顯著上調(diào)。通過(guò)si-RNA敲減ATF-2基因后發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖受到抑制。與ATF-2低表達(dá)患者相比，ATF-2高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后較差并且產(chǎn)生獲得性耐藥的概率更高[21]。在腎細(xì)胞癌組織中，ATF-2定位于細(xì)胞核中，并且ATF-2蛋白及mRNA的表達(dá)均高于相應(yīng)的鄰近正常組織。當(dāng)使用shRNA來(lái)抑制ATF2的表達(dá)時(shí)，RCC細(xì)胞增殖減少，CyclinB1和CyclinD1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生下調(diào)[22]。有報(bào)道稱(chēng)DLBCL細(xì)胞系中檢測(cè)到JNK、p38和ERK的活化及c-Jun、JunB、JunD、ATF-2、ATF-3及ATF-7的表達(dá)水平升高，當(dāng)單獨(dú)沉默c-Jun或ATF-2時(shí)，腫瘤細(xì)胞存活率明顯降低，表明c-Jun-ATF-2復(fù)合物是 DLBCL細(xì)胞系增殖的重要驅(qū)動(dòng)因子[8]。

本研究對(duì)60例DLBCL，NOS病例及40例淋巴結(jié)RH病例進(jìn)行了ATF-2蛋白的免疫組織化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示兩組病例ATF-2蛋白均定位于細(xì)胞核中，ATF-2蛋白在DLBCL，NOS中的表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)RH中的表達(dá)。這一結(jié)果提示ATF-2可能在DLBCL，NOS的發(fā)生、發(fā)展中起到一定促進(jìn)作用，并且與其細(xì)胞核定位相關(guān)。該結(jié)果與ATF-2蛋白在其他惡性腫瘤組織中的表達(dá)結(jié)果一致。

ATF-2包含有一段由5′-TGACGTCA-3′堿基序列構(gòu)成的CRE元件，所以任何在驅(qū)動(dòng)區(qū)帶有CRE結(jié)合位點(diǎn)的基因都是其潛在的靶基因[23-24]。ATF-2調(diào)控的與腫瘤發(fā)生相關(guān)的靶基因有CyclinD1和CyclinA、2OST、血小板源性生長(zhǎng)因子受體a、選擇素E、BCL-2、EMT、Snail、和Vimentin等。ATF-2與Cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)的CRE元件結(jié)合，直接激活Cyclin D1表達(dá)，Cyclin D1通過(guò)結(jié)合并激活細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶CDK4，推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入到S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，當(dāng)其過(guò)度表達(dá)時(shí)可致細(xì)胞增殖失控而惡變。本研究60例DLBCL，NOS組織中，免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示Cyclin D1蛋白均無(wú)表達(dá)?？赡艿脑蛉缦拢?1)在B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤中，由于t(11；13)(q13；q32)染色體易位導(dǎo)致的IgH/BCL1基因融合和CyclinD1蛋白過(guò)表達(dá)是套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)特征性的細(xì)胞遺傳學(xué)改變。因此，大多數(shù)Cyclin D1蛋白過(guò)表達(dá)的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤病例都診斷為MCL，而非DLBCL，NOS；(2)在DLBCL，NOS中，ATF-2可能不是調(diào)控CyclinD1基因表達(dá)的上游基因。BCL-2是最有效的抑制細(xì)胞凋亡基因之一，通過(guò)調(diào)控線粒體外膜通透性發(fā)揮作用，其啟動(dòng)子區(qū)含有一個(gè)可結(jié)合ATF-2的CRE元件。有研究表明在DLBCL，NOS中發(fā)現(xiàn)BCL-2的過(guò)表達(dá)。本研究60例DLBCL，NOS病例中，ATF-2蛋白和BCL-2蛋白免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示兩者的表達(dá)無(wú)相關(guān)性，究其原因，可能如下：(1)本組病例樣本量少，ATF-2和BCL-2蛋白在DLBCL，NOS中的關(guān)系尚需要大樣本進(jìn)行探討；(2)與其他惡性腫瘤不同，在DLBCL，NOS病例中，ATF-2可能不是通過(guò)調(diào)控BCL-2基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。(3)在DLBCL，NOS病例中，BCL-2基因的表達(dá)除受ATF-2調(diào)控外，可能還受其它基因調(diào)控。

本組60例DLBCL，NOS病例的隨訪結(jié)果與ATF-2蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果提示：ATF-2蛋白高表達(dá)的DLBCL，NOS患者與低表達(dá)的DLBCL，NOS患者總生存期的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)該結(jié)論的分析如下：本組病例樣本量較少，隨訪時(shí)間較短，部分近期確診患者處于存活期，部分病例失訪，導(dǎo)致事件數(shù)據(jù)過(guò)少。因此ATF-2的表達(dá)與DLBCL，NOS患者生存預(yù)后的關(guān)系仍需大樣本及長(zhǎng)時(shí)間隨訪進(jìn)一步研究。

綜上所述，ATF-2在DLBCL，NOS中定位于細(xì)胞核，并有可能在DLBCL，NOS的發(fā)生發(fā)展中起到一定促進(jìn)作用，但ATF-2具體通過(guò)調(diào)控哪些下游靶基因而促進(jìn)DLBCL，NOS的發(fā)生、發(fā)展以及與患者預(yù)后的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。鑒于ATF-2在腫瘤中發(fā)揮致癌作用主要與其核內(nèi)轉(zhuǎn)錄功能相關(guān)，抑制ATF-2的核內(nèi)定位及轉(zhuǎn)錄因子活性可能將為今后DLBCL，NOS治療提供一個(gè)新的參考方案。