李天博, 高磊, 王江寧

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院矯形外科(北京 100038)

骨腫瘤是發(fā)生于骨骼的惡性腫瘤。骨肉瘤作為骨腫瘤的一種，常在20歲以下年齡段發(fā)病，且患者的5年生存率很低，通過單純的手術(shù)治療，患者的生存率僅有20%左右[1-3]。因此，手術(shù)治療聯(lián)合化療等手段成為骨肉瘤最重要的治療手段之一，進而改善骨肉瘤患者的預(yù)后。順鉑、阿霉素、甲氨蝶呤等高效廣譜抗癌藥，對多種腫瘤具有良好的治療效果[4-6]。然而，腫瘤組織對化療藥物的敏感性低，導(dǎo)致了化療藥物的療效差；化療藥物本身毒副作用大、非特異性全身血液運輸，造成了全身的毒副作用[7-8]。因此，提高化療藥物在腫瘤附近的敏感性和降低全身循環(huán)成為提高化療藥物在骨肉瘤治療的關(guān)鍵所在[9]。近年來，納米生物材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于對腫瘤的診斷和治療[10-14]。其中，納米生物材料通過設(shè)計空隙結(jié)構(gòu)，用于裝載具有高毒性的化療藥物可以有效降低血液循環(huán)中的毒副作用，減少不良反應(yīng)；此外，納米藥物通過高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)，被動運輸并滯留在腫瘤環(huán)境，在腫瘤微環(huán)境進行緩釋化療藥物，進一步降低藥物在體內(nèi)積累形成的不良反應(yīng)[15-18]。此外，通過對納米藥物的腫瘤微環(huán)境(酶、酸堿性、電荷)響應(yīng)，從而控制藥物的定點釋放，達到對化療藥物的特異性給藥的目的[19-20]。碳酸鈣作為一種使用最廣泛的無機納米化合物，由于其具有高含鈣量，已經(jīng)作為補鈣技廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、生物技術(shù)等多個領(lǐng)域[21-23]。此外，通過不同的合成技術(shù)對碳酸鈣的結(jié)構(gòu)調(diào)控，可以使得碳酸鈣具有了空隙結(jié)構(gòu)，通過上載的方法，將化療藥物載入納米碳酸鈣中；此外，碳酸鈣可以在酸性環(huán)境下分解作為藥物載體后可在酸性環(huán)境緩釋化療藥物。與正常的細(xì)胞及組織相比，骨肉瘤腫瘤組織會體現(xiàn)出比較低的pH值(5.5～6.8)，通過在低pH環(huán)境的響應(yīng)，實現(xiàn)酸響應(yīng)從而可控釋放藥物。分解的鈣離子作為補鈣劑，減少骨質(zhì)由于腫瘤形成的缺損。這種既能夠降低化療藥物毒性，又能夠減少鈣缺失的治療方案有望成為骨肉瘤治療的新策略[24-28]。本研究于2018年11月至2019年8月，合成碳酸鈣納米顆粒用于包裹常用化療藥物阿霉素，通過對包裹藥物的碳酸鈣顆粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、體外細(xì)胞毒性、體內(nèi)藥物分布、體內(nèi)腫瘤抑制等不同方面評價此納米載藥體系對骨肉瘤的治療效果，希望可改善目前化療藥治療骨肉瘤過程中的不良反應(yīng)，減少患者痛苦，提升患者生活質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料 體重約25 g，5～6周雄性BALB/c裸鼠(北京維通利華公司)；鼠源骨肉瘤細(xì)胞K7(協(xié)和細(xì)胞庫購買)。

1.2 方法

1.2.1 載藥顆粒的合成 碳酸鈣納米顆粒的制備：碳酸鈣納米顆粒的制備，我們采用的是降溫制備法，從而可控地合成粒徑均一的碳酸鈣。配置2 mol/L的氯化鈣溶液，并取1.5 mL加入到反應(yīng)瓶中，加入磁子之后，放置在冰水浴中，利用磁力攪拌器以600 r/min攪拌30 min，待溶液穩(wěn)定后，以900 r/min加速攪拌溶液，并向其中緩慢滴加2.5 mL碳酸鈉溶液(冰水溶液，1 mol/L)，15 min后，向反應(yīng)瓶中加入5 mL去離子水并停止攪拌終止反應(yīng)，靜置后用過濾瓶濾出沉淀。取上清液，加入15 mL 離心管中，以5 000 r/min離心轉(zhuǎn)5 min，收集沉淀物。將沉淀物烘干備用。

載阿霉素碳酸鈣納米顆粒的制備：配制1 mol/L的DOX·HCl水溶液。精確稱取上述碳酸鈣烘干粉，利用去離子水配成質(zhì)量濃度為5 g/L的納米粒子分散液并調(diào)節(jié)其pH值至8.0。將1 mL DOX·HCl水溶液緩慢滴加到該堿性溶液中，邊滴加邊攪拌，避光室溫下攪拌過夜。反應(yīng)12 h后，通過對混合液13 000 r/min離心30 min收集沉淀物，棄上清液從而去除過量的DOX·HCl。將沉淀物利用凍干機凍干，制得復(fù)合藥物凍干粉，即制得載阿霉素碳酸鈣復(fù)合納米藥物 (以下簡稱復(fù)合藥物)。

1.2.2 復(fù)合藥物納米顆粒的表征 通過透射電鏡(TEM)測定復(fù)合藥物的顆粒形貌來驗證；通過粒度儀分析并獲得復(fù)合藥物納米顆粒的水合粒徑大小。

1.2.3 復(fù)合藥物酸響應(yīng)性的表征 配制pH值分別為5.2、6.8、7.2的緩沖溶液用于酸性響應(yīng)的檢測。稱取相同質(zhì)量的復(fù)合藥物納米顆粒，溶解于10 mL的水中并封裝入透析袋中，然后完全浸入100 mL pH值為5.2、6.8、7.2的緩沖溶液中，置于37 ℃搖床中避光恒溫震蕩。待作用2 h后，通過UV-Vis外標(biāo)法檢測復(fù)合藥物納米顆粒在不同pH值下的藥物的釋放量，并繪制圖譜。

1.2.4 細(xì)胞毒性驗證 細(xì)胞毒性實驗采用的是CCK8法。鼠源骨肉瘤細(xì)胞K7以104個/孔的數(shù)量接種到96孔培養(yǎng)板中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h。配置不同含有藥物的培養(yǎng)基，200 μL含藥物的培養(yǎng)基。藥物濃度分別為0.15、0.3、0.6、1.2、2.5、5、10 mg/mL,對照組加入與上述藥物濃度相同濃度的游離DOX溶液，給藥后共培育24 h。待孵育完全后，向孔內(nèi)加入20 μL的5 g/L CCK8溶液，隨后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸出所有培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩5 min后，檢測490 nm處的吸光度值。

篩選上述半數(shù)致死率的濃度5 mg/mL，利用該濃度給定相同的藥物，按照上述的培養(yǎng)細(xì)胞方式，將生長良好的鼠源骨肉瘤細(xì)胞K7以104個/孔的數(shù)量接種到96孔培養(yǎng)板中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h。設(shè)定7組內(nèi)部對照組，在每隔0、1、3、6、12、24、72 h向孔內(nèi)加入20 μL的5 g/L CCK8溶液，隨后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸出所有培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩5 min后，檢測490 nm處的吸光度值。

1.2.5 動物模型構(gòu)建及在體安全性驗證 取18只BALB/C小鼠，向小鼠皮下注射100 μL鼠源骨肉瘤細(xì)胞K7懸液(約含細(xì)胞2.5×106個)，制備皮下腫瘤模型。當(dāng)平均腫瘤體積大約到達50 mm3時，隨機分為3組，每組6只：DOX@CaCO3組實驗組尾靜脈注射含載藥納米微粒的PBS，DOX組尾靜脈注射含游離阿霉素的PBS，PBS組尾靜脈注射PBS，給藥量以阿霉素5 mg/kg為標(biāo)準(zhǔn)。每4 d治療1次，共治療3次。每天測量并記錄腫瘤大小和小鼠體重。

2 結(jié)果

2.1 納米復(fù)合藥物的合成驗證 如圖1-A所示：通過透射電鏡觀察可以得出，納米復(fù)合藥物的粒徑70 nm左右的規(guī)則球狀，通過灰度可以觀察發(fā)現(xiàn)，納米復(fù)合藥物為實心球狀，且分散均勻。將納米復(fù)合藥物溶解于水中，通過粒度儀檢測其水合粒徑發(fā)現(xiàn)，其水合粒徑大小為98 nm(圖1-B)；較之于透射電鏡所示，納米顆粒的水合粒徑有增加。

圖1-C所示，在pH 7.2時，通過半透膜透過的藥物含量極少，在72 h時，僅為負(fù)載量的12%，這是由于合成的復(fù)合藥物表面存在微孔，長期的水溶液會使得極少量藥物通過布朗運動擴散到水溶液中，從而通過半透膜透出；當(dāng)pH 6.8 時，水中存在的H+可以對碳酸鈣表面形成微弱的腐蝕作用，藥物的最高釋放量達到21.3%；當(dāng)pH 5.2時，水中存在的H+提高了，碳酸鈣的溶解效率提高，在72 h可以釋放62.7%的DOX藥物。

2.2 細(xì)胞毒性結(jié)果 在檢測復(fù)合納米藥物體外可行后，驗證藥物的細(xì)胞殺滅效果。如表1所示,我們利用不同濃度的藥物對細(xì)胞進行殺滅。藥物作用時間為12 h時，載藥納米微粒與游離阿霉素殺傷骨肉瘤細(xì)胞K7半數(shù)致死率的質(zhì)量濃度分別為2.6、4.5 mg/L；繼續(xù)孵育細(xì)胞，作用時間至24 h時，載藥納米微粒與游離阿霉素均將骨肉瘤細(xì)胞殺死。此外，我們利用12 h的半致死率濃度，研究藥物在不同時間段對細(xì)胞的殺傷作用。如表2所示，盡管在前24 h內(nèi)游離的DOX比納米復(fù)合藥物致死率高，然而在到72 h，納米復(fù)合藥物比DOX致死率高。

注：A：透射電鏡示意圖，復(fù)合藥物呈現(xiàn)球狀，控制粒徑在100 nm左右；B：水合粒徑示意圖，復(fù)合藥物的水合粒徑與透射電鏡展示的粒徑相符；C： 復(fù)合藥物在不同酸性環(huán)境pH 7.2、 6.8、 5.2 下藥物的釋放量

圖1復(fù)合藥物DOX@CaCO3的表征

表1 不同藥物在不同濃度作用下骨肉瘤細(xì)胞K7的平均存活率 %

表2 不同藥物作用時間下骨肉瘤細(xì)胞K7的平均存活率 %

2.3 腫瘤治療實驗結(jié)果 在活體動物中開展藥物的治療驗證。荷瘤鼠構(gòu)建成功后，分別設(shè)置3個組， 3組小鼠分別注射PBS、 DOX、 DOX@CaCO3開始治療。如圖2-A可見，經(jīng)過治療周期22 d后，PBS組腫瘤體積達(607±163) mm3，DOX組平均腫瘤體積達(514±173) mm3，DOX@CaCO3組平均腫瘤體積為(212±89) mm3。盡管DOX@CaCO3組對腫瘤具有治療作用，但仍然具有腫瘤細(xì)胞存活。圖2-A的模型動物沒有進行手術(shù)切除直接注射藥物，盡管腫瘤有一定程度的抑制，但是腫瘤還在繼續(xù)生長，只能從生長速率判定腫瘤的生長效果。為進一步驗證療效，我們決定采用先手術(shù)，切除部分腫瘤后，留下較小的瘤塊，再給藥，如圖2-B為藥物治療期間小鼠腫瘤體積變化，研究發(fā)現(xiàn)，整體給藥后的小鼠腫瘤都在變小，DOX@CaCO3組復(fù)合納米藥物組減小的趨勢明顯。

3 討論

骨肉瘤常發(fā)于青少年，術(shù)后化療是目前骨肉瘤治療最常見的方式之一。但化療藥物對骨肉瘤不敏感以及全身給藥的毒副作用，為患者造成很大的負(fù)擔(dān)[13]。鹽酸阿霉素作為細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥，對多種腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用[29]。然而，與大量的化療藥物相同，它對骨肉瘤敏感度低，且全身毒副作用也很大。近年來，新發(fā)展的復(fù)合納米藥物技術(shù)、即納米載藥系統(tǒng)為降低化療藥物毒副作用，提高藥物對腫瘤的敏感度具有良好的作用。通過溶解或包埋等技術(shù)設(shè)計納米載藥材料，將化療藥物吸附或溶解在納米顆粒內(nèi)部或表面，通過納米藥物在體EPR作用將藥物遞送到腫瘤附近，實現(xiàn)了藥物在腫瘤附近的緩釋，從而緩解了藥物在體的毒副作用。此外，納米載體可以通過設(shè)計對腫瘤微環(huán)境進行相應(yīng)，真正實驗在腫瘤環(huán)境中藥物釋放的目的。目前常用的載藥體系有脂質(zhì)體、氧化硅等物質(zhì)，然而這種物質(zhì)不具備腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的特性，因此，我們利用了一種可以在酸性環(huán)境下溶解緩釋藥物的碳酸鈣納米顆粒開展進一步的研究。

注：A：腫瘤體積變化(沒有進行手術(shù)切除)；B：腫瘤體積變化(進行了部分手術(shù)切除)

圖2復(fù)合藥物DOX@CaCO3、DOX·HCl與PBS藥物在小鼠腫瘤處的療效評估

在本次研究中，我們合成的碳酸鈣納米藥物復(fù)合物能夠?qū)崿F(xiàn)化療藥物向骨肉瘤細(xì)胞呈遞并且調(diào)控釋放的目的。透射電鏡觀察顯示，碳酸鈣納米藥物具有形態(tài)規(guī)整的、均一的球狀顆粒，粒徑大小在70 nm左右。水合粒徑的驗證證明了納米顆粒具有良好的水分散性，能夠為納米顆粒在溶液環(huán)境中酸性分解產(chǎn)生水膜。為了證明載藥納米微粒的穩(wěn)定性，實驗測量了不同pH值條件下復(fù)合納米藥物的藥物釋放水平，發(fā)現(xiàn)在常規(guī)pH值(7.2)條件下，復(fù)合納米藥物的緩釋效率很低，只有自由擴散的部分藥物；但隨著pH值降低，載藥納米微粒的結(jié)構(gòu)開始變得不穩(wěn)定，在酸性環(huán)境下降解，研究表明，藥物的釋放量與環(huán)境中的酸度呈正相關(guān)。這樣，載藥納米微粒就具備了微環(huán)境酸性降解的功能。在細(xì)胞層面，我們驗證了復(fù)合納米藥物體系對骨肉瘤細(xì)胞具有長效殺傷作用，其在24 h內(nèi)，半致死率低于游離的DOX藥物，同時這也證明了游離DOX的毒副作用比復(fù)合納米藥物的毒副作用高。在72 h的緩釋過程中，復(fù)合納米藥物明顯優(yōu)于游離阿霉素產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞殺傷作用。在體研究中，不論是直接治療組，還是手術(shù)切除后化療組，復(fù)合納米藥物都比游離的鹽酸阿霉素藥物對小鼠的腫瘤治療具有良好的作用，結(jié)果表明相對于游離阿霉素來說，載藥納米微?？擅黠@減小游離化療藥物的系統(tǒng)毒性，提高其安全性。降低了化療藥物的全身不良反應(yīng)。研究通過碳酸鈣納米顆粒實現(xiàn)了化療藥物的腫瘤部位，碳酸鈣在腫瘤微環(huán)境中緩釋藥物可以提高化療藥物的利用率，并且降低了由化療藥物帶來的不良反應(yīng)，提高治療效果。

在此次研究中所合成的復(fù)合納米藥物具有尺度均一，分散狀態(tài)良好，且在腫瘤酸性微環(huán)境可控釋放化療藥物的材料，通過體內(nèi)、外實驗證明，較之于游離阿霉素，碳酸鈣納米顆粒能夠明顯降低化療藥物在骨肉瘤治療中的細(xì)胞毒性，提高DOX在腫瘤部位的高釋放率和利用率，降低了化療藥物在機體帶來的毒副作用。因此，我們相信這種復(fù)合納米藥物在骨肉瘤的臨床化療中具有很高的應(yīng)用前景。