魏曉，張奇，張文，李慧，李培武,4,5

農產品中黃曲霉毒素產毒菌標識性分子大容量反應體系提高ELISA靈敏度

魏曉1,2,4，張奇1,2,3，張文1,3,5，李慧1,2,4，李培武1,2,3,4,5

(1中國農業(yè)科學院油料作物研究所，武漢 430062；2農業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，武漢 430062；3農業(yè)部生物毒素檢測重點實驗室，武漢 430062；4農業(yè)部油料產品質量安全風險評估實驗室，武漢 430062；5農業(yè)部油料及制品質量監(jiān)督檢驗測試中心，武漢 430062)

【】為預防和降低黃曲霉毒素污染，在前期探明黃曲霉毒素產毒菌株鑒別標識性分子PO8蛋白的基礎上，欲研究建立高靈敏、大容量反應體系的雙抗夾心ELISA檢測技術，為污染源頭監(jiān)控提供技術支撐。用干菌絲作標識性分子PO8蛋白的參考物，以高壓均質制得的黃曲霉菌裂解液為檢測抗原，純化后的PO8-VHH作包被抗體，產毒菌株多抗作檢測抗體，抗原、抗體分別以200 μL/孔加入到96孔酶標板，進行大容量反應體系夾心ELISA法的試驗。優(yōu)化相關理化因素，以陽性孔OD450nm≥1.0，陽性孔OD450nm/陰性孔OD450nm較高為原則，確定最佳試驗條件，建立標準曲線。并通過樣品添加回收試驗、重復性試驗、特異性試驗，對建立的夾心ELISA方法進行性能評估。通過棋盤格試驗確定了最佳包被抗體濃度為3.0 μg?mL-1，最佳多抗的工作濃度為2.5 μg?mL-1。優(yōu)化反應條件確定：最佳抗體包被條件為4℃過夜，最佳封閉液為3%的BSA，最佳封閉條件為37℃封閉2 h，最佳多抗作用條件為37℃反應50 min。在優(yōu)化后的條件下建立了夾心ELISA方法的標準曲線，對黃曲霉菌檢測限可達到0.1 μg?mL-1，比前期報道的常規(guī)容量反應體系靈敏度提高了約10倍。該方法特異性強，與青霉菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、赭曲霉菌均無交叉反應，且檢測非產毒黃曲霉菌株信號值較低，接近于陰性值。重復性試驗顯示，板間變異系數為1.5%—5.8%，板內變異系數為0.4%—3.2%，均小于7%，說明該方法穩(wěn)定性好。采用該方法對花生、玉米等農產品進行添加回收試驗，平均回收率在81.9%—109.0%。本研究建立的大容量反應體系夾心ELISA方法可快速、高靈敏地檢測黃曲霉毒素產毒菌，為從源頭上控制黃曲霉毒素污染提供了新的快速、方便的檢測技術支撐。

農產品；黃曲霉菌；納米抗體；ELISA；標識性分子

0 引言

【研究意義】部分黃曲霉（）和寄生曲霉（）能夠產生黃曲霉毒素（，），它具有強致癌[1]、致畸、免疫抑制性，并且毒性強、污染廣、危害重，是人類迄今發(fā)現的污染農產品和食品毒性最大、致癌力最強的一類真菌毒素[2]。黃曲霉菌可侵染大多數農產品，不僅造成巨大的經濟損失，還嚴重危害人類和動物的健康[3]。其中我國的主要油料作物花生受到黃曲霉毒素污染尤為嚴重，近年來，我國出口的花生及其制品常因黃曲霉毒素含量超標，在國際貿易市場上遭受重大經濟損失，嚴重影響了我國農產品進出口貿易的健康發(fā)展[4-5]。目前，黃曲霉毒素檢測技術已發(fā)展比較成熟[6]，但是針對的是已經被AFT污染的農產品和食品。若能在AFT產生之前，檢測到具有潛在產毒能力的黃曲霉菌，即黃曲霉毒素產毒菌，從而可以從源頭來監(jiān)控食品安全[7]。因此，建立對黃曲霉毒素產毒菌的高靈敏檢測方法，對農產品黃曲霉毒素污染源頭控制與現代農業(yè)產業(yè)高質量發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】傳統(tǒng)的黃曲霉菌檢測主要依賴于形態(tài)學特征觀察和培養(yǎng)基鑒定，但由于黃曲霉菌種類繁多、形態(tài)復雜，誤判率高[8-9]，現在逐漸用PCR方法[10-12]和免疫學檢測方法[13-16]來取代傳統(tǒng)的生化鑒定方法。由于PCR檢測方法所需儀器、試劑價格較高，且需要專業(yè)的技術人員進行操作，因此PCR檢測方法實用性不高[17]。黃曲霉菌免疫學檢測方法是基于抗體與抗原的特異性相互作用的ELISA檢測方法，目前文獻報道的真菌 ELISA 檢測方法多為雙抗體夾心ELISA法。包被抗體、抗原和檢測抗體形成“夾心式”復合物[13-14]。雙抗夾心ELISA方法要求被檢測的抗原有至少兩個以上的結合位點，這樣才可以同時被包被抗體和檢測抗體識別。ELISA檢測方法具有靈敏度高、特異性好、篩選通量高、成本低和不依賴昂貴儀器等優(yōu)點[18-19]?，F有研究用黃曲霉菌的菌絲、細胞分泌物等做抗原免疫兔子制得黃曲霉產毒菌多抗，并建立ELISA方法檢測黃曲霉菌，靈敏度達1 μg?mL-1[20-22]。Villamizar等[23]對大米中的黃曲霉菌進行檢測，靈敏度達10 μg?g-1。也有研究者制備黃曲霉菌單克隆抗體，利用ELISA方法檢測黃曲霉菌[24-26]。XUE等[27]對花生中黃曲霉菌的最低檢測限可達1 μg?g-1?！颈狙芯壳腥朦c】WANG等[7]利用黃曲霉菌表面蛋白、分泌蛋白和胞內蛋白作為抗原免疫羊駝和大耳兔，成功獲得黃曲霉菌的納米抗體和多抗。經試驗證明研制出的PO8納米抗體能夠識別黃曲霉和寄生曲霉中的單一條帶（45 kD），對非曲霉屬真菌和細菌沒有交叉反應，并且該蛋白可較為容易地分泌到細胞外，這使得利用PO8-VHH檢測黃曲霉毒素產毒菌更加有望成為可能。然而WANG等[7]建立的黃曲霉菌檢測方法靈敏度較低（1 μg?mL-1）?！緮M解決的關鍵問題】建立大容量反應體系的夾心ELISA檢測方法，富集PO8蛋白以提高檢測靈敏度，并優(yōu)化相關反應條件，以實現對黃曲霉毒素產毒菌的高靈敏和快速精準測定。

1 材料與方法

試驗于2018年在中國農業(yè)科學院油料作物研究所進行。

1.1 材料和試劑

黃曲霉菌株3.4408、黃曲霉菌PO8納米抗體、菌多抗均為本實驗室保存，花生、玉米購于武漢中百超市，DNA marker購于寶生物工程有限公司，BSA購于美國Sigma公司，HRP標記羊抗兔IgG購于武漢博士德生物公司，X-Tractor細胞裂解液、HisPur鎳柱NTA樹脂購于美國Clontech公司，HRP標記抗HA標簽鼠單抗購于北京康為世紀有限公司，氨芐青霉素鈉鹽（Amp）購于美國Amresco公司。

1.2 儀器與設備

恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床購于美國Thermo Fisher公司，高壓均質機ATS1500購于加拿大ATS公司，水平凝膠電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)購于北京六一儀器廠，酶標儀購于美國分子儀器公司，全自動洗板機、96孔酶標板購于美國Costar公司。

1.3 抗原的制備

將黃曲霉菌的干菌絲作為標識性分子PO8蛋白的參考物質。將黃曲霉菌3.4408的孢子液加至Czapek培養(yǎng)基中，使終濃度為5×105cfu/mL，于28℃搖床培養(yǎng)5 d后，用滅菌濾紙過濾收集菌絲，并用液氮充分研磨至粉末溶解在PBS中，隨后用高壓均質儀充分裂解黃曲霉菌菌絲，制得黃曲霉菌裂解液作為抗原，抗原濃度以菌絲量計。

1.4 PO8納米抗體的純化與驗證

將pComb3x-PO8/Top10F在LB-Amp固體培養(yǎng)基上進行活化。從平板上挑單克隆接種到SB-Amp液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，37℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm為0.6—0.8，加入1 mol?mL-1IPTG溶液。次日，3 000×離心30 min，棄上清液收集菌體，將菌體用細胞裂解液裂解，收集上清用PBS（0.01 mol?L-1，pH 7.4）緩沖液透析過夜。將透析后的溶液離心以去除細胞碎片，取上清液通過鎳柱純化。用SDS-PAGE電泳對各流出液進行分析，混合純的納米抗體流出液，用PBS緩沖液透析過夜，超濾濃縮透析液，最后用考馬斯亮藍法測其濃度，分裝儲存于-20℃[28]。將黃曲霉菌裂解液梯度稀釋至10-3、10-2、10-1、1、10、102、103和104μg?mL-1包被酶標板，用間接ELISA方法測定純化后的納米抗體親和力。

1.5 包被抗體和檢測抗體工作濃度設置

將純化后的PO8-VHH分別以3、2、1和0.5 μg?mL-1加入96孔酶標板，并設置5個重復孔，包被量為每孔200 μL，4℃包被過夜。次日，用PBST洗板3次。隨后加入3% BSA作為封閉液，每孔300 μL，37℃條件下封閉2 h。取出后，用PBST洗板3次。將黃曲霉菌裂解液稀釋至100 μg?mL-1，以200 μL每孔加入酶標板，37℃反應1 h。取出后用PBST洗板3次。用兔多抗做檢測抗體，將菌多抗用PBS分別稀釋至4、3、2.5、2、1.5、1和0.5 μg?mL-1。分別以200 μL每孔加入酶標板，37℃反應50 min。取出后，用PBST洗板3次。每孔加入200 μL HRP標記的羊抗兔抗體（1﹕5 000），37℃反應1 h。取出后用PBST洗板6次。最后每孔加入100 μL的TMB顯色液，37℃避光反應15 min后加入終止液終止反應，立即于酶標儀上讀取OD450nm值。

1.6 抗體包被條件設置

采用確定的抗體包被濃度和多抗稀釋度，分別以37℃ 2 h，37℃ 1 h，4℃ 12 h共3種不同的條件包被PO8納米抗體，用夾心ELISA方法測定OD450nm，并分析P/N值，確定最佳抗體包被條件。

1.7 封閉液設置

分別在37℃以5%脫脂奶粉、3%脫脂奶粉、3%BSA共3種封閉液進行封閉，其他條件不變，進行夾心ELISA方法測定OD450nm，分析P/N值，確定最佳封閉液。

1.8 封閉時間處理

分別以37℃ 3 h、37℃ 2 h 、37℃ 1 h三種不同條件進行封閉，其他條件不變，夾心ELISA方法測定OD450nm，并分析P/N值，確定最佳封閉時間。

1.9 多抗工作時間的確定

將多抗分別在37℃條件下分別作用30、50和60 min，夾心ELISA方法測定OD450nm，分析P/N值，確定最佳多抗工作時間。

1.10 夾心ELISA方法標準曲線的繪制

按照已確定的條件，將黃曲霉菌裂解液梯度稀釋至10-3、10-2、10-1、1、10、102、103和104μg?mL-1，以200 μL/孔加入酶標板，用夾心ELISA法測定OD450nm值。以黃曲霉菌裂解液濃度為橫坐標，以OD450nm值為縱坐標，繪制標準曲線。ELISA檢測的標準曲線可通過下面的公式進行擬合：

450nm==min+

式中，為實際測定的結合反應吸光度值，B為最小吸光度值，B為最大吸光度值，為測定濃度，50為半最大效應濃度，為斜率。

1.11 夾心ELISA方法特異性的建立

用1.3的方法制備青霉菌（HBHA）、尖孢鐮刀菌（FO）、串珠鐮刀菌（FV）、赭曲霉菌（AO）細胞裂解液。用優(yōu)化的反應條件建立的夾心ELISA方法，檢測青霉菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、赭曲霉菌細胞裂解液，PBS作為陰性對照，每組設置5個重復，檢驗該方法的特異性。

用從江西、湖北等地采集的黃曲霉菌株（5種產毒菌株和5種不產毒菌株）分別接種健康、無霉變的花生，15 d后將被菌侵染后的花生粉碎，稱取適量花生粉末懸浮于PBS緩沖液中。將樣品稀釋至0.5 mg?mL-1，包被ELISA板，用建立的ELISA方法進行測定，以檢測該方法與不產毒的黃曲霉菌是否有交叉反應。

1.12 重復性試驗

用同批次包被的ELISA板分別檢測4份陽性樣品和1份陰性樣品，并設置5個重復計算批內變異系數。用不同批次包被的ELISA板同時檢測4份陽性樣品和1份陰性樣品，計算批間變異系數，評價該方法的重復性。變異系數CV（%）=標準偏差/平均值×100。

1.13 添加回收率測定

將健康（表皮完整、無霉菌）的花生、玉米粉碎，稱取0.1 g加入到10 mL PBST緩沖液中懸浮，添加不同濃度的黃曲霉菌裂解液（100、10和1 μg?mL-1），取200 μL加入酶標板，通過ELISA方法計算回收率。

2 結果

2.1 黃曲霉菌PO8-VHH的純化鑒定

將純化后的PO8-VHH進行SDS-PAGE電泳，結果如圖1所示，PO8-VHH分子量約為17 kD，與預期大小相符，且條帶單一。用考馬斯亮藍法測蛋白濃度為550 μg?mL-1，說明純化效果良好。用間接ELISA方法鑒定純化的PO8-VHH與制得的黃曲霉菌裂解液的結合力如圖2所示，PO8-VHH（5 μg?mL-1）可最低識別到10 μg?mL-1的黃曲霉菌絲。

2.2 包被抗體和檢測抗體最佳工作濃度

棋盤法確定最佳VHH包被濃度和菌多抗工作濃度（表1）。抗體工作濃度的選擇應遵循以下兩個原則：①OD450nm值接近于1.0；②抗體用量少為佳；根據表1中結果可確定最佳VHH包被量為3.0 μg?mL-1，最佳多抗工作濃度為2.5 μg?mL-1。

M：蛋白分子量標準 Protein Marker；1：PO8-VHH

圖2 納米抗體與黃曲霉菌的親和力分析

2.3 抗體包被條件的確定

抗體包被條件的不同會對ELISA反應產生影響，測定結果見圖3，4℃包被過夜條件下P（陽性值）/N（陰性值）值平均數最大且P值大于1.0，因此，4℃過夜為最佳抗體包被條件。

2.4 最佳封閉液的確定

封閉試劑的選擇能夠影響ELISA的非特異性吸附，從而影響ELISA的靈敏度。因為用納米抗體作包被抗體易出現假陽性，因此本試驗加大了封閉液的濃度。由圖4可知，3% BSA封閉液的P/N值最高，為最佳封閉液。

表1 不同濃度包被抗體和多抗ELISA結果

圖中不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（P＜0.05）。下同

圖4 不同封閉液的P/N值

2.5 最佳封閉時間的確定

如圖5所示，在37℃封閉2 h條件下P/N值最高，且OD450nm＞1.0，所以2 h為最佳封閉時間。

2.6 最佳多抗作用時間的確定

由圖6可知，在37℃反應50 min 條件下P/N值最高，且OD450nm＞1.0，為最佳多抗作用時間。

圖5 不同封閉時間的P/N值

圖6 不同多抗工作時間的P/N值

2.7 夾心ELISA方法標準曲線的繪制

建立的該大容量反應體系夾心ELISA方法對黃曲霉菌檢測限可達到0.1 μg?mL-1。黃曲霉菌干菌絲濃度的對數值與OD450nm值之間進行非線性擬合，相關系數較高（2＞0.99）（圖7），表明建立的標準曲線準確度較高。

圖7 大容量反應體系夾心ELISA方法標準曲線

2.8 夾心ELISA方法特異性的確定

用優(yōu)化后的雙抗體夾心ELISA方法檢測青霉菌（HBHA）、尖孢鐮刀菌（FO）、串珠鐮刀菌（FV）、赭曲霉菌（AO），結果均無交叉反應，陰、陽性均成立（表2）。用建立的ELISA方法分別檢測被產毒菌株和非產毒菌株侵染的花生材料，結果顯示，非產毒黃曲霉菌株的信號值較低，接近于陰性值（表3）。表明建立的大容量夾心ELISA方法具有良好的特異性。

2.9 重復性試驗

用優(yōu)化后的雙抗體夾心ELISA方法對板內、板間重復性進行驗證。分別檢測5份不同樣品的OD值，并計算其變異系數。結果如表3、表4所示，板間變異系數為1.5%—5.8%，板內變異系數為0.4%—3.2%，均小于7%，說明建立的大容量夾心ELISA檢測方法具有一定的穩(wěn)定性。

2.10 添加回收率試驗

為評估新建立的黃曲霉毒素產毒菌標識性分子的大容量反應體系ELISA檢測方法在樣品分析中的有效性，對易染黃曲霉的花生、玉米進行黃曲霉菌絲加標和回收研究試驗。本試驗的模擬樣本中，菌絲的添加濃度分別為100、10和1 μg?mL-1，用已建立并優(yōu)化的方法檢測，結果如表5所示，樣品中黃曲霉菌絲的平均回收率在81.9%—109.0%，符合一般情況。

表2 特異性試驗結果

表3 ELISA檢測被黃曲霉菌污染的花生

表4 板內重復性

3 討論

黃曲霉菌侵染花生、玉米等經濟作物，造成重大的經濟損失，其產生的黃曲霉毒素屬于I類致癌物，嚴重危害人和動物的健康[29-30]，因此針對黃曲霉毒素以及產毒菌的檢測已成為近年來的發(fā)展熱點。目前，針對黃曲霉毒素的檢測方法已比較成熟，如黃曲霉毒素免疫親和檢測技術，靈敏度可達0.003—0.01 μg?kg-1[31-34]，我國自主研發(fā)的黃曲霉毒素單光譜成像檢測儀，靈敏度最高可達0.03 ng?mL-1。但是目前針對黃曲霉毒素產毒菌的檢測發(fā)展比較緩慢，黃曲霉菌免疫學檢測方法主要是基于多抗、單抗等傳統(tǒng)抗體建立的ELISA檢測方法，傳統(tǒng)抗體存在均一性差、特異性差、生產周期較長等缺點。筆者實驗室用黃曲霉菌表面蛋白、分泌蛋白和胞內蛋白作為抗原免疫羊駝率先制備了針對黃曲霉菌的納米抗體，具有特異性強、親和力高、溶解度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[35-39]，為黃曲霉毒素產毒菌的檢測提供了關鍵技術支撐。WANG等[7]建立的夾心ELISA檢測方法靈敏度較低，且未對其建立的方法進行性能評估。本研究針對其不足，研究建立了大容量反應體系的納米抗體-多抗夾心ELISA檢測方法，加大抗原的用量富集黃曲霉菌標識性分子PO8蛋白以提高檢測靈敏度，并優(yōu)化相關理化條件，使該方法能夠以低至10-1μg?mL-1的濃度檢測到黃曲霉菌，與王婷的檢測限（1 μg?mL-1）相比，靈敏度提高了10倍。并對易感染黃曲霉菌的花生、玉米進行加標回收試驗，證明該方法可應用于實際農產品中黃曲霉菌的檢測與分析。

表5 添加樣品回收率

結果為3 d間測定結果的平均值The result is the average value of 3 days

不同的黃曲霉菌株產毒力有差別，現有的檢測方法大多需要培養(yǎng)黃曲霉菌若干天才能檢測毒素，這樣一方面浪費時間，另一方面容易產生誤差，所以需要研究一種快速鑒別菌株產毒力的方法。本研究用納米抗體作捕獲抗體的靈敏度未及XUE等[27]用單鏈抗體作捕獲抗體的靈敏度。但納米抗體分子量（15 kD）明顯小于單鏈抗體（25 kD），不易聚集且更加穩(wěn)定[40-41]，這對于利用納米抗體建立黃曲霉分子預警技術具有重要意義。

4 結論

本研究采用黃曲霉菌干菌絲作為抗原，黃曲霉毒素產毒菌標識性分子PO8蛋白的納米抗體作為捕獲抗體，菌多抗作為檢測抗體，通過增大免疫反應體系容量和優(yōu)化系列反應條件，研究建立了一種大容量反應體系的夾心ELISA檢測方法，對黃曲霉菌的檢測限可達0.1 μg?mL-1，靈敏度比前期報道的常規(guī)反應容量方法提高了約10倍。因此，本研究建立的檢測方法具有靈敏度高、特異性強、重復性好的特點，為從源頭上控制農產品黃曲霉毒素污染提供了關鍵方法。

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Improving the Sensitivity of ELISA by Large-capacity Reaction System of Aflatoxigenic Fungi-biomarker in Agro-products

WEI Xiao1,2,4, ZHANG Qi1,2,3, ZHANG Wen1,3,5, LI Hui1,2,4, LI PeiWu1,2,3,4,5

(1Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062;2Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062;3Key Laboratory of Detection for Mycotoxins, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062;4Laboratory of Risk Assessment for Oilseeds Products (Wuhan) , Ministry of Agriculture, Wuhan 430062;5Quality Inspection and Test Center for Oilseeds Products, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062)

【】In order to prevent and reduce the contamination byspecies from the source, a highly sensitive large-capacity reaction system DAS-ELISA was established, based on the biomarker PO8 protein of aflatoxigenic fungi. This study aimed to provide key technical support for pollution source monitoring. 【】In this study, the dry mycelium was used as a reference for the biomarker PO8 protein, the mycelia lysate made by high pressure homogenization was used as envelope antigen, the purified PO8-VHH was used as capture antibody, and rabbit polyclonal antibody againstwas used as detection antibody. The antigen and antibody were added to the 96-well microtiter plate at 200 μL/well, and the sandwich ELISA for the large-capacity reaction system was carried out. Based on the principle that the positive hole OD450nm≥1.0, the positive hole OD450nm/negative hole OD450nmwas higher to determine the optimal experimental conditions and to establish a standard curve. The performance of the established sandwich ELISA method was evaluated by spike-and-recovery test, repeatability test and specific test. 【】Assays were performed in the PO8-VHH (3 μg?mL-1) coated ELISA format, in which the detection antibody was 2.5 μg?mL-1diluted. The optimized physicochemical factors in the performance were obtained: the antibody coating condition was 4℃ overnight, the blocking reagent was 3% BSA, the blocking condition was 37℃ 2h, and the polyclonal antibody working time was 50 min. The standard curve was established under the optimal conditions, the minimum detectable limit was 0.1 μg?mL-1. This method was specific, with no cross reaction with HBHA, FO, FV, and AO. Meanwhile, the inter-assay repetition rate was 1.5%-5.8% and intra-assay repetition rate was 0.4%-3.2%, both lower than 10%, indicating it was good repeatability. Non-aflatoxigenic fungi had lower values, close to negative value. 【】The large-capacity reaction system sandwich ELISA method established in this study could quickly and accurately detect aflatoxigenic fungi, which laid a foundation for further control of aflatoxin contamination from the source.

agro-products;;nanobody; ELISA; biomarker

2019-08-09；

2019-11-05

國家重點研發(fā)計劃（2018YFC1602505）、國家自然科學基金（31801665）、湖北省技術創(chuàng)新專項重大項目（2018ABA081）、湖北省自然科學基金（2017CFB333）

魏曉，Tel：13163292893；E-mail：15621567212@163.com。通信作者張奇，E-mail：zhangqi01@caas.cn

（責任編輯 趙伶俐）