秦姣姣 楊玉琦 胡曉艷

摘要：銀杏（Ginkgo biloba L.）是雌雄異株植物，其植株價(jià)值因性別不同而異。銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中EST-SSR位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析將為銀杏遺傳學(xué)研究開展提供重要的理論與方法支持。首先通過高通量測序技術(shù)獲得銀杏大、小孢子葉球轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，然后開展數(shù)據(jù)拼接組裝與EST-SSR位點(diǎn)挖掘及相應(yīng)的生物信息學(xué)分析。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理及拼接組裝后共獲得108 307條unigenes，然后利用MISA軟件發(fā)掘銀杏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的SSR位點(diǎn)，最終從8 178條unigenes中檢索出9 668個(gè)SSR位點(diǎn)。其中，單核苷酸重復(fù)的數(shù)量最多，有5 663個(gè);其次是二核苷酸和三核苷酸，重復(fù)數(shù)量分別為2 471、1 438個(gè);四核苷酸至六核苷酸重復(fù)的數(shù)量相對較少，共有96個(gè)。銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)共包含147種重復(fù)基元。在單核苷酸重復(fù)中，A和T是優(yōu)勢重復(fù)基元類型，分別有2 808、2 685個(gè);在二核苷酸重復(fù)基元中，AT與TA數(shù)量較多，分別為469、383個(gè)，所占比例為34.48%。此外，設(shè)計(jì)得到6 809對銀杏EST-SSR位點(diǎn)特異引物。銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)的發(fā)掘?qū)殂y杏遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳性狀分析、幼年期性別鑒定方法的建立等提供有力的理論與方法支持。

關(guān)鍵詞：銀杏;轉(zhuǎn)錄組;SSR位點(diǎn);重復(fù)基元

中圖分類號：S664.301 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）03-0090-05

微衛(wèi)星序列（simple sequence repeat，SSR）是指由1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，如Tn、（AG）n、（ATG）n、（ATGC）n等，在真核生物基因組中隨機(jī)分布。不同物種間SSR位點(diǎn)的分布差異較大，主要表現(xiàn)在基序類型、重復(fù)長度以及在染色體上的分布情況等，從而反映出物種間高水平的等位基因多樣性。雖然不同物種間SSR位點(diǎn)的差異性較大，但是SSR位點(diǎn)兩端的序列比較保守，因此可以根據(jù)SSR位點(diǎn)兩端的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物以獲得其長度多態(tài)性，即SSR分子標(biāo)記。SSR分子標(biāo)記技術(shù)除了具有操作簡單、易檢測、共顯性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)外，還具有特異性強(qiáng)、等位基因變異多、受選擇壓力小等特點(diǎn)[1]。開發(fā)SSR分子標(biāo)記的傳統(tǒng)方法所需費(fèi)用高、工作量大，并且成功獲得陽性克隆和多態(tài)性引物的概率偏低[2]。當(dāng)前，高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速，測序成本顯著降低，為SSR分子標(biāo)記開發(fā)提供了一種全新的方法。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）可以全面快速地獲得某一特定組織或器官在特定狀態(tài)下幾乎所有的轉(zhuǎn)錄組信息，也可以根據(jù)測序結(jié)果開發(fā)特異EST-SSR分子標(biāo)記[3]。目前，RNA-Seq技術(shù)已在刺梨（Rosa roxbunghii）[4]、魚腥草（Houttuynia cordata）[5]、杜仲（Eucommia ulmoides）[6]等多種植物上開發(fā)出EST-SSR分子標(biāo)記，并應(yīng)用于多領(lǐng)域遺傳分析。

銀杏（Ginkgo biloba L.）為銀杏科銀杏屬落葉喬木，雌雄異株，有“金色活化石”之稱，具有良好的觀賞特性與藥用價(jià)值[7]。銀杏種子含有銀杏酸等多種生理藥理活性物質(zhì)[8]，但銀杏種子成熟后外種皮有惡臭[9]，易污染環(huán)境，故在園林綠化上宜使用雄株。銀杏采果園的建設(shè)與園林綠化中的資源配置都要求將雌雄株區(qū)分開來，然而銀杏實(shí)生苗在定植后需15～20年才開花，繼而才能肉眼分辨出雌雄，這顯然不能滿足早期定植時(shí)對雌雄性別區(qū)分的要求。形態(tài)特征鑒別法簡單易行，但仍處于定性階段，缺乏準(zhǔn)確的定量標(biāo)準(zhǔn);同工酶法及染色體核型分析法均可靠，但難以應(yīng)用于大規(guī)模實(shí)踐;分子標(biāo)記法及特異蛋白方面的研究更為準(zhǔn)確，但需更高的科技支撐[10]。因此，開發(fā)快捷、有效和可靠的銀杏雌雄株早期性別鑒定方法，對銀杏的資源配置及實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。利用雌雄特異的EST-SSR標(biāo)記位點(diǎn)，已經(jīng)成功地開發(fā)出一種早期鑒別杜仲性別的方法[11]。尋找在銀杏雌雄株中存在的與性別相關(guān)聯(lián)的特異EST-SSR標(biāo)記位點(diǎn)，或許可以成為快速準(zhǔn)確地鑒別銀杏性別的方法，為制定科學(xué)合理的配置應(yīng)用方案提供有力的技術(shù)支持。

本研究通過RNA-Seq技術(shù)對銀杏大、小孢子葉球進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝后獲得unigenes，再對unigenes中包含的EST-SSR位點(diǎn)進(jìn)行分析，明確銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)的組成和分布特征，為后續(xù)銀杏遺傳分析及早期性別鑒定方法的建立等研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 銀杏來源與總RNA提取

銀杏采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院銀杏種質(zhì)資源圃，選取來自于同一家系的銀杏25年生雌雄實(shí)生苗各5株，于2015年3月取初開的銀杏大孢子葉球（雌花）和小孢子葉球（雄花）各10個(gè)作為試驗(yàn)材料。每棵樹采集2個(gè)樣本，每5個(gè)樣本作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共設(shè)置2個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所采樣品用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。使用改良的CTAB法[12]抽取銀杏總RNA，利用Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量和完整性。當(dāng)總RNA的濃度大于400 ng/μL、28S/18S>1.8時(shí)，表明所提取的RNA符合轉(zhuǎn)錄組測序的要求。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序及序列拼接組裝

利用NEB Next UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，USA）構(gòu)建cDNA文庫，然后利用Illumina Hiseq 2500測序平臺對構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行雙末端測序。對測序得到的原始序列進(jìn)行去接頭、去低質(zhì)量讀段和去重復(fù)等處理后，使用軟件Trinity[13]進(jìn)行de novo組裝，最終得到盡可能長的unigenes。

1.3 銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)挖掘

利用MISA軟件[14]對銀杏轉(zhuǎn)錄組unigenes序列進(jìn)行EST-SSR位點(diǎn)搜索，搜索標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

1.4 銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

利用Primer 3.0進(jìn)行銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)，軟件參數(shù)設(shè)置采用默認(rèn)值，針對檢索到的每一個(gè)EST-SSR位點(diǎn)同時(shí)設(shè)計(jì)3對特異引物供后期試驗(yàn)選擇。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

經(jīng)Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測后發(fā)現(xiàn)，總RNA濃度為845.7 ng/μL，28S/18S為2.01，表明本研究提取的銀杏總RNA樣品質(zhì)量高，能夠滿足后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序的要求。

2.2 原始序列組裝結(jié)果

銀杏轉(zhuǎn)錄組測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)組裝拼接后共得到108 307條unigenes，這些unigenes的總長度為 86 212 372 bp，平均長度為796 bp。序列長度大于1 000 bp的unigenes有23 624條，占全部unigenes的21.81%（圖1）。

2.3 銀杏EST-SSR位點(diǎn)數(shù)量分布特征

如表2所示，銀杏轉(zhuǎn)錄組unigenes序列經(jīng)檢索后，共發(fā)現(xiàn)8 178條unigenes含有9 668個(gè)EST-SSR位點(diǎn)，占總unigenes數(shù)量的7.55%。從銀杏轉(zhuǎn)錄組unigenes中共檢索到6種核苷酸重復(fù)類型，出現(xiàn)數(shù)量最多的是單核苷酸重復(fù)，占總EST-SSR位點(diǎn)數(shù)量的58.57%，其次是二核苷酸重復(fù)，占 25.55%，數(shù)量最少的是五核苷酸重復(fù)，僅占0.14%。

2.4 銀杏EST-SSR重復(fù)基元的分布特征

如圖2所示，在9 668個(gè)銀杏EST-SSR位點(diǎn)中，共有147種重復(fù)基元出現(xiàn)， 其中單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、 五核苷酸及六核苷酸重復(fù)基元的種類分別有4、12、60、44、13、14種。單核苷酸重復(fù)基元中，A和T是優(yōu)勢重復(fù)基元類型，分別有2 808、2 685個(gè)，占單核苷酸重復(fù)的97.00%;二核苷酸重復(fù)基元中，出現(xiàn)次數(shù)最多的是AT，有469個(gè)，占二核苷酸重復(fù)的18.98%，其次是TA，有383個(gè)，占15.50%;三核苷酸重復(fù)基元中，出現(xiàn)頻率最高的為GAA，占三核苷酸重復(fù)的4.79%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元類型數(shù)量最少，占總EST-SSR位點(diǎn)數(shù)量的1.01%。

2.5 銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

如表3所示，采用Primer 3.0軟件對本研究檢索到的銀杏EST-SSR位點(diǎn)進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì)，共得到6 809對特異引物，成功率為70.43%。在設(shè)計(jì)成功的6 809對引物中，擴(kuò)增產(chǎn)物為單核苷酸重復(fù)的最多，有4 012個(gè)，占58.92%;其次為二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元，分別有2 413、1 095個(gè)，分別占35.44%、16.08%。另外，PCR產(chǎn)物為復(fù)合型重復(fù)（含有1個(gè)以上重復(fù)基元類型）的有921個(gè)，占13.53%。

2.6 銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)的可用性評價(jià)

多態(tài)性是判定分子標(biāo)記可用性的重要參考指標(biāo)之一，對于SSR分子標(biāo)記來說，長度是影響其多態(tài)性高低的一個(gè)重要因素。研究表明，當(dāng)SSR長度大于20 bp時(shí)，此位點(diǎn)具有高度多態(tài)性，當(dāng)長度在 12～20 bp之間，此位點(diǎn)具有中等水平的多態(tài)性，而長度小于12 bp的SSR位點(diǎn)多態(tài)性較低[15]。因此本研究中對銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)進(jìn)行搜索時(shí)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為單核苷酸重復(fù)至少10次，二核苷酸重復(fù)至少6次，而三核苷酸至六核苷酸的重復(fù)次數(shù)要大于5次。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)的長度集中分布在12～45 bp之間，其中長度大于20 bp的EST-SSR位點(diǎn)共有734個(gè)，占總EST-SSR位點(diǎn)的7.59%;長度在12～20 bp之間的 EST-SSR位點(diǎn)有4 944個(gè)，占總數(shù)的51.14%。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，高級重復(fù)基元類型SSR位點(diǎn)的多態(tài)性要低于低級重復(fù)基元類型[16]。在本研究中檢索到的銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)主要是低級重復(fù)基元類型SSR位點(diǎn)，如單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重復(fù)所占比例高達(dá)84.28%，對銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)長度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，長度大于20 bp的734個(gè)EST-SSR位點(diǎn)中，單核苷酸、二核苷酸重復(fù)基元類型有471個(gè)， 占比達(dá)到64.17%，表明這部分銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)具有高度多態(tài)性潛能，有很好的利用潛質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

SSR位點(diǎn)廣泛分布于真核生物基因組中，據(jù)統(tǒng)計(jì)，真核生物基因組中每隔10～50 kb就存在1個(gè)SSR位點(diǎn)，在植物基因組中，平均每23.3 kb就有1個(gè)SSR位點(diǎn)[17]。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究涉及的物種越來越廣泛，尤其是基因組序列還未公布的物種，產(chǎn)生了大量的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，對于這些數(shù)據(jù)的深度挖掘成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究通過RNA-Seq技術(shù)對銀杏大、小孢子葉球進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)過拼接組裝后得到108 307條unigenes，檢索后得到符合條件的EST-SSR位點(diǎn)9 668個(gè)，出現(xiàn)頻率為8.92%，其出現(xiàn)頻率明顯高于魚腥草[5]、云南松[18]等物種，低于刺梨[4]等物種。造成不同物種間 EST-SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率差異的原因可能是物種間SSR位點(diǎn)組成及分布的差異性。銀杏轉(zhuǎn)錄組中 EST-SSR位點(diǎn)種類與數(shù)量均比較豐富，可為銀杏SSR分子標(biāo)記的開發(fā)提供重要的參考。

不同物種之間EST-SSR位點(diǎn)主要重復(fù)類型同樣有所差異。很多植物的EST-SSR位點(diǎn)主要以二核苷酸、三核苷酸重復(fù)基元類型為主，比如云南松[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)重復(fù)基元類型主要以單核苷酸重復(fù)為主，占全部SSR位點(diǎn)的58.57%，其次是二核苷酸重復(fù)，這與紅松[19]、白皮松[20]等相似，但與云南松[18]、魚腥草[5]、刺梨[4]等物種有差異，這些物種EST-SSR位點(diǎn)的主要重復(fù)基元是三核苷酸重復(fù)。SSR位點(diǎn)基序類型中普遍存在A/T優(yōu)勢，而G/C重復(fù)基序類型出現(xiàn)頻率較低，在多數(shù)植物中很難發(fā)現(xiàn)。導(dǎo)致上述現(xiàn)象的可能原因是打破A/T堿基對之間氫鍵所需的能量要低于G/C堿基對，基因組中A/T的波動較G/C容易[21]。但也有觀點(diǎn)認(rèn)為，基因組甲基化使C轉(zhuǎn)化為T，同時(shí)3′末端polyA序列插入形成富含A的原始SSR位點(diǎn)，導(dǎo)致重復(fù)基序中A/T優(yōu)勢的出現(xiàn)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)重復(fù)基序類型中單核苷酸重復(fù)基元類型出現(xiàn)最多的是A與T，兩者構(gòu)成的SSR位點(diǎn)占總SSR位點(diǎn)數(shù)量的56.82%。其次，二核苷酸重復(fù)基元類型中，AT和TA重復(fù)基序類型出現(xiàn)次數(shù)同樣很高，所占SSR位點(diǎn)比例分別為4.85%、3.96%，表現(xiàn)出較明顯的A/T優(yōu)勢。而G/C在所有重復(fù)基元類型中的出現(xiàn)頻率較低，由C和G組成的單核苷酸重復(fù)基元共19個(gè)，占總SSR位點(diǎn)的0.16%，二核苷酸重復(fù)中GC和CG所占的比例僅分別為0.01%、0.003 7%。銀杏轉(zhuǎn)錄組EST-SSR位點(diǎn)不僅出現(xiàn)頻率高、平均分布頻率廣，且類型豐富，具有較高的多態(tài)性潛能和可用性。本研究積累了大量銀杏EST-SSR位點(diǎn)并明確了其基本特征，可為開發(fā)銀杏SSR分子標(biāo)記奠定重要的理論基礎(chǔ)。本研究的開展對于加快銀杏功能基因資源的開發(fā)利用，建立銀杏種質(zhì)資源評價(jià)和改良機(jī)制、快速準(zhǔn)確的苗期性別鑒定方法等具有重要的意義。

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