李龍， 劉海潮， 胡振紅， 夏飛， 劉玉榮， 徐瑞娟

中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院呼吸內(nèi)科(湖北武漢 430070)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害人類健康。每年超過300萬人死于COPD，占全球死亡人數(shù)第4名[1-2]。2018年我國新發(fā)布的COPD流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示>40歲人群中COPD患病率為13.7%[3]。原發(fā)性肺癌簡稱肺癌，是全球腫瘤死亡最主要原因，2012年全球新發(fā)肺癌人數(shù)為182.5萬，死亡人數(shù)159萬[4]。2015年我國肺癌發(fā)病人數(shù)73.3萬，死亡人數(shù)61萬[5]。COPD是肺癌的獨立危險因素，40%～70%的肺癌患者合并COPD，兩者存在某種共同發(fā)病機(jī)制。PIK3CA基因突變激活PI3K-AKT-mTOR信號在COPD及肺癌的發(fā)生、發(fā)展中均起到重要作用。既往報道均將COPD和肺癌單獨進(jìn)行研究，然而兩者通常共同存在，本研究通過收集COPD合并非小細(xì)胞肺癌臨床樣本，檢測PI3KCA基因突變現(xiàn)狀，結(jié)合臨床特征進(jìn)行綜合分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2012年1月至2016年1月確診非小細(xì)胞肺癌120例患者，COPD的診斷依據(jù)COPD全球倡議，肺功能使用公司肺功能儀測定；非小細(xì)胞肺癌的診斷依據(jù)組織病理，非小細(xì)胞肺癌TNM分期依據(jù)國際肺癌研究協(xié)會第8版進(jìn)行。研究對象均神志清楚，無精神疾患，無嚴(yán)重心臟、腎臟、肝臟相關(guān)疾病。COPD合并非小細(xì)胞肺癌患者60例，其中男50例，女10例，年齡49～72歲，平均(65±6.75)歲；單純肺癌患者60例，男34例，女26例，年齡48～73歲，平均(65±7.45)歲，兩組患者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 臨床樣本 患者病理樣本行HE染色診斷為非小細(xì)胞肺癌，且樣本中腫瘤組織含量>50%，病理組織樣本行切片，每張厚度為5 μm，至少5張以上，室溫保存。

1.2.2 樣本DNA提取 采用Qiagen公司DNA提取試劑盒，提取組織樣本基因組DNA，試驗操作嚴(yán)格按照說明進(jìn)行，DNA樣本必須滿足OD260/OD230≥1.7，OD260/OD280=1.8±0.2，且濃度≥10 ng/μL，放至-20℃保存。

1.2.3 PIK3CA基因定量檢測 采用雅康博生物公司生產(chǎn)的人PIK3CA基因突變試劑盒行樣本基因突變檢測，PCR儀器為Stratagene Mx3000p，循環(huán)設(shè)置條件為90℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)。

1.2.4 Ion Torrent測序 首先進(jìn)行DNA文庫制備，采用雅康博生物公司的科吉安肺癌文庫試劑盒，試驗操作嚴(yán)格按試驗說明進(jìn)行，特異引物與DNA模板結(jié)合，高保真聚合酶底物為脫氧核苷酸，對待檢基因特定序列進(jìn)行擴(kuò)增，同時對該特定產(chǎn)物添加特定核苷酸序列，獲得DNA文庫。步驟包括待測DNA特定序列體外擴(kuò)增，添加接頭，條碼DNA文庫純化及定量等操作步驟。其次進(jìn)行油包水PCR及富陽極性模板，油包水PCR儀器采用Ion onetouch，試劑盒采用Ion PGMTMTemplate Reagent 200試劑盒，富陽極模板采用 Ion onetouch ES儀器。最后進(jìn)行PGM測序，采用Ion PGMTMSequencing 200V2試劑盒，試驗操作嚴(yán)格按照說明進(jìn)行，采用北京康雅博公司生物信息學(xué)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料進(jìn)行2檢驗，對計量資料進(jìn)行t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD合并肺癌患者與單純肺癌患者臨床特征表現(xiàn) 60例COPD組患者，依據(jù)COPD全球倡議肺功能分級，GOLD 1級44例(73.3%)、GOLD 2級15例(25.0%)、GOLD 3級1例(1.7%)，吸煙55例(91.7%)，鱗癌患者45例(75.0%)，腺癌患者15例(25.0%)。依據(jù)國際肺癌研究協(xié)會第8版分期，Ⅰ期 36例(60.0%)、Ⅱ期15例(25.0%)、Ⅲ期8例(13.3%)、Ⅳ期1例(1.7%)。男50例(83.3%)，女10例(16.7%)。60例非COPD組患者中，吸煙39例(65.0%)，鱗癌患者 28例(46.7%)、腺癌患者32例(53.3%)。依據(jù)國際肺癌研究協(xié)會第8版分期，Ⅰ期 42例(70.0%)、Ⅱ期 9例(15.0%)、Ⅲ期8 例(13.3%)，Ⅳ期 1例(1.7%)。男34例(56.7%)，女26例(43.3%)。COPD組中患者男性、病理類型為鱗癌、吸煙患者占比高于非COPD組。COPD組中央型肺癌22例(36.6%)、非COPD組中央型肺癌10例(16.7%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 COPD組患者與非COPD組患者PIK3CA基因突變情況 COPD組PIK3CA基因突變患者7例(11.7%)，2例為H1047R，3例為E545K，2例為E542K。非COPD組PIK3CA基因突變患者1例(1.7%)，為H1047R。COPD組PIK3CA基因突變頻率較非COPD組明顯升高(P=0.028)。在鱗癌患者中，PIK3CA突變率與肺癌患者肺功能嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。在腺癌患者中，PIK3CA突變率與肺癌患者肺功能嚴(yán)重程度無明顯相關(guān)性。COPD組7例PIK3CA基因突變患者中，3例為中央型肺癌，4例為周圍型肺癌，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1120例肺癌患者臨床特征 例(%)

2.3 PIK3CA基因突變與患者臨床特征相關(guān)性 將PIK3CA基因突變與患者臨床特征進(jìn)行單因素變量分析，COPD組患者PIK3CA基因突變較非COPD組明顯升高(P=0.028)。年齡、腫瘤分期、吸煙指數(shù)、病理類型與PIK3CA基因突變無明顯相關(guān)性，見表2。以COPD狀態(tài)、年齡、腫瘤分期、病理類型、吸煙指數(shù)等進(jìn)行多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，只有COPD與PIK3CA基因突變關(guān)系顯著，見表3。

2.4 PIK3CA基因突變基因型 COPD組中PIK3CA基因突變?yōu)?例，2例為H1047R，3例為E545K，2例為E542K,非COPD組中PIK3CA基因突變?yōu)?例，為H1047R。E545K及E542K為C：G>T：A堿基替換，H1047R為A：T>G：C堿基替換。C：G>T：A堿基替換占比為62.5%；A：T>G：C堿基替換占比37.5%。

表2 單因素變量分析 例(%)

表3 多因素logistic回歸分析

3 討論

PIK3CA基因最早由Volinia于1994年發(fā)現(xiàn)，定位于3q26.3,長34 kb，含20外顯子，編碼1 068種氨基酸[6]。PIK3CA編碼蛋白即PI3Kp110α，是類磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol3-kinases，PI3Ks)p110催化亞單元[7]。當(dāng)PIK3CA基因突變，導(dǎo)致PIK3CA編碼蛋白過度表達(dá)，PI3K催化活性增強(qiáng)，PI3K-AKT-mTOR信號通路被激活，PI3K-AKT-mTOR信號通路在細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡以及葡萄糖代謝，蛋白質(zhì)合成中密切相關(guān)[8-9]。同時有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中PI3K-AKT-mTOR信號通路被激活，與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[10]。

已有研究報道PIK3CA基因突變或基因擴(kuò)增導(dǎo)致PI3K信號通路激活在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[11-12]。在氧化應(yīng)激驅(qū)動下，肺上皮細(xì)胞PI3K表達(dá)增加，激活PI3K-AKT-mTOR信號通路，促進(jìn)細(xì)胞衰老，炎癥蛋白釋放，與COPD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。PI3K信號通路通過氧化應(yīng)激被激活，是COPD肺上皮細(xì)胞增殖及凋亡抑制的重要驅(qū)動因素[14]。以上說明氧化應(yīng)激以及PI3K信號通路在COPD及肺癌的發(fā)生、發(fā)展中均起到重要作用。

目前文獻(xiàn)報道肺癌中PIK3CA基因突變率為5%～5.7%，其中腺癌中突變率為3%，鱗癌中突變率為5%～10%[15]。本研究中肺癌突變率為6.7%，腺癌中PIK3CA基因突變頻率為2.1%，鱗癌中突變頻率為9.6%，與國內(nèi)外報道相近。

COPD是肺癌的獨立危險因素，40%～70%肺癌患者合并COPD。在吸煙人群中，肺功能下降者肺癌發(fā)病率是肺功能正常者5倍，并且隨著肺功能下降程度增加，肺癌發(fā)病率逐漸上升[16-18]。既往研究均將COPD和肺癌單獨進(jìn)行，然而兩者通常共同存在，本研究中COPD組PIK3CA基因突變率為11.7%，非COPD組PIK3CA基因突變率為1.7%，COPD組PIK3CA基因頻率明顯升高。本研究中將PIK3CA基因突變與患者臨床特征進(jìn)行單因素變量分析，COPD組患者PIK3CA基因突變較非COPD組明顯升高(P=0.028)。年齡、腫瘤分期、吸煙量、病理類型與PIK3CA基因突變無明顯相關(guān)性。以COPD狀態(tài)，年齡、腫瘤分期、病理類型、吸煙量等進(jìn)行多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，只有COPD與PIK3CA基因突變關(guān)系顯著。

本研究中8例患者出現(xiàn)PIK3CA基因突變，非COPD組1例，COPD組7例，其中3例患者突變點為E545K，2例患者突變點為E542K，3例患者突變點為H1047R，E545K及E542K為C：G>T：A堿基替換，H1047R為A：T>G：C堿基替換。C：G>T：A堿基替換占比為62.5%,在PIK3CA突變中占主要地位。有研究報道APOBEC酶在C：G>T：A堿基替換的過程中發(fā)揮重要作用[19]。另外有研究發(fā)現(xiàn)約85%PIK3CA基因突變發(fā)生在含有APOBEC酶環(huán)境中[20]。這些研究可以推測COPD合并肺癌患者，APOBEC酶活性及表達(dá)明顯增強(qiáng)。

明確COPD與肺癌發(fā)病機(jī)制有助于預(yù)防COPD患者肺癌的發(fā)生，同時對于COPD合并肺癌患者提供新的治療靶點。細(xì)胞調(diào)控相關(guān)信號通路的激活導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控已被證實是COPD合并肺癌的發(fā)病機(jī)制之一[21-23]。調(diào)控細(xì)胞增殖的PI3K信號可以預(yù)防COPD患者肺癌的發(fā)生。目前已有多個治療COPD合并肺癌的臨床試驗正在進(jìn)行，PI3K信號通路可能是潛在的靶點之一。COPD可能是肺癌的驅(qū)動因素，其機(jī)制可能包括氧化應(yīng)激引起的DNA損傷和細(xì)胞增殖[24]。COPD合并肺癌PIK3CA基因突變的存在可能為這兩種疾病提供新的治療方向，但還需要進(jìn)一步研究。

本研究的創(chuàng)新點在于將COPD合并肺癌作為研究主體，研究COPD合并非小細(xì)胞肺癌患者PIK3CA基因突變特點。COPD組患者PIK3CA基因突變頻率更高。PIK3CA基因突變是COPD合并肺癌患者特有的特征，與性別、年齡、病理類型、腫瘤分期、吸煙等無關(guān)。后期研究需要闡明COPD合并肺癌患者PIK3CA基因突變的具體機(jī)制，為該合并癥的治療提供理論依據(jù)。