張麗華， 黃云華， 羅景梅， 吳斌， 何君一， 李嶸

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1老年內(nèi)分泌科， 2內(nèi)分泌一科(云南昆明 650031)； 3云南省第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科(云南昆明 650031)

糖尿病目前已成全球流行趨勢(shì)，2016年全球糖尿病患者已達(dá)4.22億[1]。糖尿病腎臟疾病 (diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病的主要并發(fā)癥，我國(guó)2型糖尿病腎病社區(qū)患病率為30%～50%，住院患者中約占40%[2]。DKD是糖尿病微血管病變引起的腎損害，腎纖維化是其病理特征之一[3]。但現(xiàn)有治療策略不能逆轉(zhuǎn)DKD的進(jìn)展。微小核糖核酸(microRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)約21～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小編碼單鏈RNA，通過(guò)堿基配對(duì)原則，與靶基因3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)序列結(jié)合，抑制蛋白翻譯或促進(jìn)mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]。研究顯示microRNA參與了腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制[5]。我們既往研究顯示，miR-433是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1) /Smad3信號(hào)通路誘導(dǎo)腎纖維化的重要參與者， 正反饋放大TGF-β1/ Smad3誘導(dǎo)的腎纖維化效應(yīng)；下調(diào)miR-433的表達(dá)可顯著減輕腎纖維化[6]。但下調(diào)miR-433表達(dá)，是否減輕DKD腎纖維化，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究2016年10月至2019年2月通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討在高糖刺激條件下，miR-433是否參與腎纖維化，并進(jìn)一步明確miR-433在高糖刺激引起腎纖維化中的作用機(jī)制，為探討治療DKD的療法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠TECs(NRK52E，ATCC，Manassas，VA)和MMCs(大鼠系膜細(xì)胞系，1099，ATCC，Manassas，VA)培養(yǎng)于Dulbecco改良Eagle′s培養(yǎng)基，5%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素(Life Technologies，Carlsbad，CA)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，然后給于不同濃度高糖(12.5 mmol/L、25 mmol/L和50 mmol/L) (Life Technologies，Carlsbad，CA)刺激24 h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測(cè)miR-433表達(dá)，摸索出最適宜的高糖刺激濃度25 mmol/L。再用25 mmol/L高糖濃度刺激細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)(0、12、24和48 h)檢測(cè)miR-433表達(dá)。

1.2 高糖刺激NRK52E和MMCs細(xì)胞模型構(gòu)建和纖維化指標(biāo)檢測(cè) 大鼠TECs和MMCs培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化后，以25 mmol/L高糖濃度刺激細(xì)胞，對(duì)照組TECs和MMCs葡萄糖濃度為5.6 mmol/L。細(xì)胞培養(yǎng)0、48 h后進(jìn)行相關(guān)纖維化指標(biāo)[膠原Ⅰ、Ⅳ(Col-Ⅰ、Col-Ⅳ)、粘連蛋白(FN)和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)]的檢測(cè)。

1.3 高糖刺激大鼠穩(wěn)定表達(dá)miR-433上調(diào)及miR-433下調(diào)NRK52E和MMCs細(xì)胞系miR-433和纖維化指標(biāo)的表達(dá) 按文獻(xiàn)方法[6]構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)miR-433上調(diào)及miR-433下調(diào)NRK52E和MMCs細(xì)胞系，即將質(zhì)粒按試劑盒說(shuō)明書(shū)(Ambion, Austin, TX)分別轉(zhuǎn)染入NRK52E和MMCs細(xì)胞，分別用G418和puromycin(Sigma, St Louis, MO)篩選，穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功后，25 mmol/L高糖刺激，采用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)miR-433和纖維化指標(biāo)表達(dá)變化。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法 按Taqman MicroRNA Assay(Applied Biosystems, Foster City, CA)試劑盒說(shuō)明書(shū)和Multiplex RT kit (Invitrogen，Carlsbad，CA) 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取microRNA和RNA，進(jìn)一步檢測(cè)miR-433和纖維化指標(biāo)(Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、FN和α-SMA)，RT-PCR引物序列按文獻(xiàn)[6]。

1.5 Western blot分析 采用試劑盒(美國(guó)Cell Sinaling Techonology)按說(shuō)明書(shū)提取NRK52E和MMCs細(xì)胞蛋白。10%SDS-PAGE(SDS，UltraPure Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸素纖維膜，TBS/T洗膜，5%脫脂奶粉室溫下阻斷60 min。分別加入Col Ⅰ(Southern Tech, Birmingham,AL)、Col Ⅳ、FN(Dako, Carpinteria, CA)、α-SMA(Sigma, St Louis,MO)或β-Actin 一抗[1∶1 000(美國(guó) Santa Cruz)]4℃孵育過(guò)夜。洗膜后分別加入二抗(Santa Cruz,Biotechnology, Santa Cruz, CA) 室溫孵育1 h，洗膜后加入發(fā)光劑(美國(guó)Cell Sinaling Techonology)，X線膠片曝光。凝膠圖像成像系統(tǒng)成像及掃描定量分析蛋白質(zhì)帶的相對(duì)含量。計(jì)算與β-Actin比值。

2 結(jié)果

2.1 高糖刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞miR-433和纖維化指標(biāo)的表達(dá)

2.1.1 不同葡萄糖濃度刺激NRK52E后qRT-PCR miR-433/u6表達(dá) 對(duì)NRK52E用不同濃度高糖(0、12.5、25和50 mmol/L)刺激24 h，miR-433表達(dá)隨高糖刺激濃度的增加呈進(jìn)行性升高(P<0.001)，最適濃度為25 mmol/L。見(jiàn)圖1、表1。

注：與0 mmol/L比較 *P<0.01，**P<0.001

圖1不同葡萄糖濃度刺激NRK52E后qRT-PCRmiR-433/u6表達(dá)比較

表1不同葡萄糖濃度刺激NRK52E后qRT-PCRmiR-433/u6的表達(dá)比值

葡萄糖濃度nmiR-433/u60 mmol/L30.60±0.0512.5 mmol/L31.20±0.2025 mmol/L32.20±0.0650 mmol/L32.30±0.05

2.1.2 25 mmol/L葡萄糖濃度刺激NRK52E不同時(shí)間qRT-PCR miR-433/u6的表達(dá) 采用25 mmol/L葡萄糖濃度刺激不同時(shí)間(0、12、24和48 h)，miR-433表達(dá)在48 h達(dá)高峰(P<0.001)，見(jiàn)圖2、表2。

2.1.3 25 mmol/L葡萄糖濃度刺激NRK52E不同時(shí)間qRT-PCR纖維化指標(biāo)的表達(dá) 纖維化指標(biāo)Col-Ⅰ、α-SMA和FN的表達(dá)在高糖刺激48 h后明顯增加(P<0.001)。見(jiàn)圖3、表3。

2.2 高糖刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞miR-433和纖維化指標(biāo)的表達(dá) 以25 mmol/L葡萄糖濃度刺激MMCs 48 h，miR-433和纖維化指標(biāo)：Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、FN和α-SMA(圖2-B～E)在MMCs中的表達(dá)顯著升高。高糖刺激48 h，miR-433的表達(dá)與刺激的葡萄糖呈濃度和時(shí)間依賴； 高糖刺激48 h后Col Ⅰ、 Col-Ⅳ、 FN和α-SMA表達(dá)增加。見(jiàn)圖4、5和表4、5。

注：與0 mmol/L比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖2以25mmol/L葡萄糖濃度刺激NRK52E不同時(shí)間qRT-PCRmiR-433/u6的表達(dá)

表2以25mmol/L葡萄糖濃度刺激NRK52E在不同時(shí)間qRT-PCRmiR-433/u6表達(dá)比值

葡萄糖濃度0 h 12 h 24 h48 h25 mmol/L0.40±0.011.20±0.141.70±0.062.50±0.130 mmol/L0.37±0.050.39±0.150.40±0.070.28±0.12

注：*與0 mmol/L比較 P<0.001

葡萄糖濃度Col-Ⅰα-SMAFN0 h48 h0 h48 h0 h48 h25 mmol/L0.16±0.020.47±0.020.02±0.0020.03±0.0022.30±0.135.10±0.280 mmol/L0.16±0.020.16±0.020.02±0.0020.02±0.0022.00±0.102.80±0.15

注：*與0 mmol/L比較 P<0.001

圖4以25mmol/L葡萄糖濃度刺激MMCs不同時(shí)間qRT-PCRmiR-433/u6的表達(dá)

表4以25mmol/L葡萄糖濃度刺激MMCs不同時(shí)間qRT-PCRmiR-433/u6表達(dá)比較

葡萄糖濃度0 h48 h25 mmol/L0.61±0.132.30±0.140 mmol/L0.53±0.040.73±0.05

2.3 高糖刺激大鼠穩(wěn)定表達(dá)miR-433上調(diào)及miR-433下調(diào)NRK52E細(xì)胞系 miR-433和纖維化指標(biāo)的表達(dá) 以25 mmol/L葡萄糖濃度刺激NRK52E 24 h，miR-433和纖維化指標(biāo)：Col-Ⅰ、FN和α-SMA在miR-433上調(diào)NRK52E細(xì)胞系中的表達(dá)顯著升高，而在miR-433下調(diào)NRK52E細(xì)胞系中的表達(dá)顯著降低。見(jiàn)圖6～8、表6～8。

注：*與0 mmol/L比較P<0.001

葡萄糖濃度Col-ⅠCol-ⅣFNα-SMA0 h48 h0 h48 h0 h48 h0 h48 h25 mmol/L0.40±0.041.10±0.080.28±0.070.77±0.040.16±0.0020.55±0.0020.32±0.020.58±0.020 mmol/L0.32±0.060.36±0.080.26±0.040.23±0.020.15±0.0010.16±0.0060.28±0.010.30±0.02

注：與對(duì)照組比較 *P<0.05，**P<0.001；與同組0 h比較，#P<0.01，##P<0.001

圖6以25mmol/L葡萄糖濃度刺激NRK52E不同時(shí)間qRT-PCRmiR-433/u6的表達(dá)

2.4 高糖刺激大鼠穩(wěn)定表達(dá)miR-433上調(diào)及miR-433下調(diào)MMCs細(xì)胞系 miR-433和纖維化指標(biāo)的表達(dá) 以25 mmol/L葡萄糖濃度刺激MMCs 48 h，miR-433和纖維化指標(biāo)：Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、FN和α-SMA在miR-433上調(diào)MMCs細(xì)胞系中的表達(dá)顯著升高，而在miR-433下調(diào)MMCs細(xì)胞系中的表達(dá)顯著降低。見(jiàn)圖9～11、表9～11。

3 討論

DKD是糖尿病微血管?chē)?yán)重并發(fā)癥之一，其病理實(shí)質(zhì)為腎纖維化，高血糖是DKD啟動(dòng)和進(jìn)展最關(guān)鍵因素，長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物(AGEs) 形成，后者與系膜細(xì)胞的特異受體結(jié)合，促腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生FN、Col-Ⅳ等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，促進(jìn)腎小球基底膜增厚，系膜擴(kuò)張，腎小球肥大，腎小球硬化。Col-Ⅳ是基底膜和系膜的主要成分, 其過(guò)度沉積與DKD病情進(jìn)展密切相關(guān)[7]。FN主要表達(dá)于DKD患者腎小球和腎小管，反映腎纖維化程度，是DKD進(jìn)展的指標(biāo)[8]。細(xì)胞骨架蛋白α-SMA這一肌成纖維細(xì)胞出現(xiàn)的標(biāo)志，參與了腎纖維化過(guò)程[9]。

TGF-β1是目前已知最重要的促纖維化因子，它促進(jìn)ECM的生成并抑制其降解[6, 10]。腎小球和腎小管間質(zhì)TGF-β1高表達(dá)的現(xiàn)象已在動(dòng)物模型和DKD患者中證實(shí)。高糖可以上調(diào)近端腎小管、腎小球上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞TGF-β1 mRNA 的表達(dá)和蛋白的合成；TGF-β1 在腎小管間質(zhì)纖維化中主要由受損傷的腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)自分泌及旁分泌方式引起腎細(xì)胞肥大、ECM積聚，最終導(dǎo)致腎臟纖維化。TGF-β1合成過(guò)多或活性增強(qiáng)導(dǎo)致腎臟ECM合成增多和系膜區(qū)擴(kuò)張，腎臟肥大，出現(xiàn)DKD的典型病理改變。

表6以25mmol/L葡萄糖濃度刺激NRK52E不同時(shí)間qRT-PCRmiR-433/u6的表達(dá)

組別0 h 6 h 12 h24 hmiR-433上調(diào)組0.52±0.121.00±0.121.88±0.042.99±0.07miR-433下調(diào)組0.36±0.130.43±0.120.47±0.210.52±0.02對(duì)照組0.41±0.140.81±0.121.33±0.152.22±0.04

注：與對(duì)照組比較 *P<0.001， ? P<0.05；與同組0 h比較,#P<0.01

組別Col-Ⅰα-SMAFN0 h48 h0 h48 h0 h48 hmiR-433上調(diào)組0.24±0.020.54±0.02 0.03±0.004 70.08±0.002 42.2±0.136.2±0.28miR-433下調(diào)組0.16±0.020.22±0.020.01±0.000 30.03±0.002 21.8±0.112.8±0.15對(duì)照組0.19±0.020.44±0.040.03±0.004 40.06±0.005 92.0±0.304.5±0.37

注：與對(duì)照組比較 *P<0.05,##P<0.01;?P<0.05，??P<0.01，???P<0.001

圖8以25mmol/L葡萄糖濃度刺激NRK52E不同時(shí)間Westernblot纖維化指標(biāo)比較

組別Col-Ⅰα-SMAFN0 h48 h0 h48 h0 h48 hmiR-433上調(diào)組0.13±0.0050.18±0.0050.83±0.020.91±0.010.69±0.051.00±0.04miR-433下調(diào)組0.11±0.0030.14±0.0030.71±0.010.78±0.010.55±0.020.79±0.02對(duì)照組0.12±0.0040.17±0.0050.79±0.010.84±0.020.69±0.060.88±0.03

注：與對(duì)照組比較 *P<0.05，**P<0.001；與同組0 h比較，#P<0.01，##P<0.001

圖9以25mmol/L葡萄糖濃度刺激MMCs不同時(shí)間qRT-PCRmiR-433/u6的表達(dá)

表9以25mmol/L葡萄糖濃度刺激MMCs不同時(shí)間qRT-PCRmiR-433/u6的表達(dá)

組別0 h 6 h 12 h24 hmiR-433上調(diào)組1.3±0.151.9±0.082.80±0.224.5±0.14miR-433下調(diào)組0.8±0.131.1±0.060.96±0.121.1±0.11對(duì)照組1.0±0.091.2±0.051.50±0.252.9±0.17

注：與對(duì)照組比較 *P<0.001，?P<0.05; #與同組0 h比較P<0.01

圖10以25mmol/L葡萄糖濃度刺激MMCs不同時(shí)間qRT-PCR纖維化指標(biāo)比較

組別Col-ⅠCol-ⅣFNα-SMA0 h48 h0 h48 h0 h48 h0 h48 hmiR-433上調(diào)組0.38±0.051.00±0.070.18±0.030.42±0.051.20±0.0045.20±0.580.08±0.030.21±0.017miR-433下調(diào)組0.32±0.020.50±0.040.14±0.030.23±0.020.82±0.0031.80±0.450.05±0.010.10±0.01對(duì)照組0.36±0.060.81±0.030.15±0.010.33±0.0060.99±0.3103.50±0.170.07±0.010.16±0.01

注：與對(duì)照組比較 *P<0.05， #P<0.01；?P<0.01，??P<0.001

組別Col-ⅠCol-ⅣFNα-SMA0 h48 h0 h48 h0 h48 h0 h48 hmiR-433上調(diào)組0.42±0.0140.54±0.020.40±0.020.59±0.050.74±0.051.30±0.070.78±0.061.70±0.07miR-433下調(diào)組0.34±0.0130.39±0.030.31±0.010.39±0.030.53±0.020.92±0.030.47±0.030.61±0.03對(duì)照組0.35±0.0260.50±0.020.34±0.030.49±0.040.60±0.030.95±0.060.67±0.061.30±0.07

既往研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1中和抗體(如anti-TGF-β2 IgG4)[11]，TGF-β的反義寡核苷酸或可溶性人TGF-βII型受體[12]，抑制腎纖維化、減少蛋白尿緩解了DKD。但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)DKD患者使用TGF-β1的中和抗體，雖安全，但不能延緩DKD進(jìn)展[13]。Smad3的特異性抑制劑減輕了內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，延緩了腎病進(jìn)展，但卻沒(méi)有降低蛋白尿[14]。并且，阻斷TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，可能損害TGF-β的抗炎特性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

新近研究證實(shí)多種miRNAs與DKD進(jìn)展有著密切的關(guān)系[5]。我們研究發(fā)現(xiàn)，miR-433是腎組織中的促纖維化miRNA，可正反饋放大TGF-β1/Smad3腎纖維化信號(hào)通路，而抑制miR-433表達(dá)，可減輕腎纖維化[6]。Zhu等[15]研究證實(shí)，伴隨糖尿病大鼠腎組織纖維化病理改變，腎臟miR-433和TGF-β1 mRNA和蛋白水平顯著升高，促激肽釋放的胰激肽原酶(PKase)腹腔注射治療后，miR-433和TGF-β1 mRNA和蛋白水平顯著降低，腎纖維化減輕。本研究顯示，下調(diào)miR-433表達(dá)，顯著減輕了腎小管和系膜細(xì)胞Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、FN和α-SMA的表達(dá)。早期DKD患者中，尿miR-433排泄增加[16]。由此，miR-433可作為DKD早期診斷的生物學(xué)標(biāo)記；下調(diào)miR-433的表達(dá)，可抑制DKD腎纖維化。因此，探索miR-433在DKD進(jìn)展中的作用，對(duì)于發(fā)現(xiàn)利于DKD早期診斷的生物學(xué)指標(biāo)和有效治療手段，具有極其重要的臨床價(jià)值。