鄭若曦，吳廣文，，陳 俊，邱建清，劉淑如，劉南航

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是在力學(xué)和生物學(xué)因素等多種因素共同作用下，軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、軟骨下骨三者降解-合成偶聯(lián)失衡的結(jié)果[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎呈現(xiàn)出一種涉及免疫的炎癥環(huán)境[2]和營養(yǎng)缺乏的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[3]，這種環(huán)境是一種持久的障礙，觸發(fā)了細(xì)胞凋亡和新生血管產(chǎn)生。因而，如何克服這種涉及免疫的炎癥環(huán)境和應(yīng)激反應(yīng)可能是有效治療OA的方法。SDF-1/CXCR4信號通路在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)等方面具有重要作用[4]。

獨活寄生湯臨床廣泛用于膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)的治療，療效可靠[5-10]。前期研究[11-17]表明，獨活寄生湯可有效延緩軟骨退變，但是否通過調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4信號通路發(fā)揮作用尚不明確。本研究以SD大鼠KOA動物模型為研究對象，通過觀察獨活寄生湯對SDF-1/CXCR4信號通路相關(guān)調(diào)節(jié)因子的影響，探討?yīng)毣罴纳鷾委烱OA的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

2月齡SPF級SD大鼠，雄性，45只，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK(滬)2017-0005。

1.2 主要試劑與儀器

SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-13一抗(美國abcam公司)；MMP-9一抗(美國cell signaling公司)；二抗(美國Millipore公司)；SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13引物(福州尚亞生物技術(shù)有限公司)；酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)；ABI實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；蛋白核酸分析儀(美國Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1 分組與模型復(fù)制

45只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組和治療組3組，15只/組?？瞻捉M不做處理；模型組和治療組均在1、4、7天雙膝關(guān)節(jié)腔注射4%木瓜蛋白酶復(fù)制KOA動物模型[18]。術(shù)后2周，治療組給予獨活寄生湯臨床等效劑量[19]，按照9.3 g·kg-1·d-1的劑量進(jìn)行灌胃，空白組和模型組給予等量的0.9%生理鹽水灌胃，共治療8周。

2.2 組織取材與處理

末次灌胃結(jié)束后，按照3 mL/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，膝關(guān)節(jié)備皮，于髕韌帶附著點外上方，用1 mL醫(yī)用注射器穿刺入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，注入滅菌生理鹽水，反復(fù)活動膝關(guān)節(jié)，抽取關(guān)節(jié)液，置入EP管中，-80 ℃保存，用于SDF-1檢測；隨后打開膝關(guān)節(jié)腔，收集膝關(guān)節(jié)滑膜組織，保存在液氮中，用于SDF-1 mRNA和蛋白檢測；取完滑膜組織后，切取脛骨平臺和股骨下端軟骨組織，迅速置入液氮中保存，用于CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白的檢測。

2.3 ELISA法檢測關(guān)節(jié)液中SDF-1含量

取出-80 ℃保存?zhèn)溆玫母鹘M關(guān)節(jié)液，參照試劑盒說明書測定各組樣本中SDF-1含量。

2.4 Real-time PCR法檢測各組滑膜組織中SDF-1和軟骨組織中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA表達(dá)

取出液氮中保存?zhèn)溆玫母鹘M滑膜組織和軟骨組織，勻漿后，Trizol法提取總RNA；核酸分析儀檢測各樣本RNA濃度和OD260/280值。根據(jù)試劑盒說明書，取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以1 μL cDNA為模板擴(kuò)增SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13和GAPDH。以GAPDH為內(nèi)參照基因，計算各目的基因2-ΔΔCt，比較各目的基因mRNA表達(dá)水平。

2.5 Western blot法檢測各組滑膜組織中SDF-1和軟骨組織中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達(dá)

取出液氮中保存?zhèn)溆玫母鹘M滑膜組織和軟骨組織，勻漿后，提取各組總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，Western blot法檢測SDF-1、 CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達(dá)情況。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 獨活寄生湯對大鼠關(guān)節(jié)液中SDF-1含量的影響

模型組大鼠中SDF-1含量較空白組增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。采用獨活寄生湯治療后，大鼠關(guān)節(jié)液中SDF-1含量降低，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：與空白組相比，a Pb P

3.2 獨活寄生湯對大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織SDF-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中SDF-1 mRNA表達(dá)升高到(2.601 2±0.086 4)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，治療組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中SDF-1 mRNA表達(dá)降低至(1.907 1±0.046 5)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。獨活寄生湯對SDF-1蛋白的影響與其對SDF-1 mRNA的影響具有類似的趨勢，即與空白組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中SDF-1蛋白表達(dá)升高；經(jīng)過獨活寄生湯治療后，SDF-1蛋白表達(dá)降低。見圖3。

注：與空白組相比，a Pb P

3.3 獨活寄生湯對大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組大鼠軟骨組織中CXCR4 mRNA表達(dá)升高至(1.501 1±0.02)，MMP-3 mRNA表達(dá)升高至(2.263 8±0.089 5)，MMP-9 mRNA表達(dá)升高至(2.081 7±0.077 3)，MMP-13 mRNA表達(dá)升高至(2.274 1±0.065)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，治療組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中CXCR4 mRNA表達(dá)降低至(1.228 1±0.105 3)，MMP-3 mRNA表達(dá)降低至(1.656 2±0.058 1)，MMP-9 mRNA表達(dá)降低至(1.518 6±0.045 7)，MMP-13 mRNA表達(dá)降低至(1.518 1±0.098)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。獨活寄生湯對CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達(dá)的影響與其對CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA的影響具有類似的趨勢，即與空白組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達(dá)均升高；與模型組相比，治療組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達(dá)均降低。見圖5。

圖3 干預(yù)后各組大鼠SDF-1蛋白表達(dá)情況

注：與空白組相比，a Pb P

4 討論

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種合并滑膜及關(guān)節(jié)內(nèi)局部炎癥的疾病?；⑴c關(guān)節(jié)軟骨代謝活動，滑膜體積增加可能伴隨軟骨降解[20]。Wei L等[21]研究表明滑膜受到刺激后，炎性滑膜可能分泌一些因子，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞釋放基質(zhì)降解酶，從而造成軟骨破壞。然而關(guān)節(jié)滑膜軟骨的代謝活動受何種信號通路調(diào)節(jié)，具體作用機(jī)制不明。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)是骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的CXC類趨化蛋白，最初被認(rèn)為是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、骨髓內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生[22-23]，后來發(fā)現(xiàn)KOA患者關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞也會分泌SDF-1到滑液中[24]，若SDF-1與軟骨細(xì)胞表面的CXCR4受體結(jié)合，就能激活Erk及p38 MAPK等信號通路，從而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞釋放MMP-3、9、13等，進(jìn)而誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨破壞[24-25]。Kanbe等[26]采用ELISA法測定55例KOA患者滑液中的SDF-1濃度，發(fā)現(xiàn)患者滑液中SDF-1的含量均高于正常人。Kanbe等[27]發(fā)現(xiàn)將SDF-1加入到軟骨細(xì)胞內(nèi)會誘導(dǎo)MMP-9和MMP-13的釋放，而將SDF-1加入到滑膜成纖維細(xì)胞則不會改變MMP-9和MMP-13的濃度?？傊琒DF-1/CXCR4信號通路在KOA患者的病理進(jìn)程中具有重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)KOA模型大鼠關(guān)節(jié)液中SDF-1含量明顯高于空白組，經(jīng)過獨活寄生湯治療后，SDF-1含量降低。進(jìn)一步采用Real-time PCR和Western blot法，從基因和蛋白兩個方面檢測滑膜組織中SDF-1的表達(dá)情況，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)與空白組相比，KOA大鼠SDF-1表達(dá)明顯增多，而經(jīng)過獨活寄生湯治療后SDF-1表達(dá)量明顯下降。與此同時，本研究同時采用Real-time PCR和Western blot法檢測大鼠軟骨組織中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組相比，KOA大鼠CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表達(dá)明顯增多，經(jīng)過獨活寄生湯治療后大鼠CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表達(dá)量明顯下降。由此推測獨活寄生湯可能是通過調(diào)節(jié)滑膜組織中SDF-1和軟骨組織中CXCR4的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)軟骨組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá)，起到防治KOA的作用，但是否是唯一途徑，尚需要后期研究進(jìn)一步驗證。

5 結(jié)論

綜上所述，獨活寄生湯可通過調(diào)控SDF-1/CXCR4信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)因子MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá)，從而起到防治KOA的作用。