靳亞忠 陳業(yè)雯 龍閃閃 李康樂 馬曉偉 何淑平 齊紅巖

(1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

甜瓜(Cucumis meloL.)是一種高經(jīng)濟(jì)價值的作物，近年來已成為黑龍江省設(shè)施生產(chǎn)中的主要種植對象。隨著生活水平的提高，消費者對果實品質(zhì)的要求不斷提高。甜瓜中糖組分及其含量對果實內(nèi)在品質(zhì)有著重要的影響，是決定果實品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[1-3]。研究表明，影響甜瓜果實糖分含量的因素很多，其中氮肥對果實糖分的積累具有明顯的調(diào)節(jié)作用[1，3-5]，且隨著化學(xué)氮肥用量的增加甜瓜果實滴定酸含量升高、可溶性固形物含量降低[4-5]、可溶性糖含量和糖酸比降低[3，5]。通過減少化學(xué)氮肥或部分替代使用化學(xué)氮肥，進(jìn)而提高甜瓜甜度已成為生產(chǎn)者和科研工作者的關(guān)注熱點之一。已有研究表明，有機(jī)肥及其與化學(xué)氮肥的配施，可以提高番茄[6]、西瓜[7-8]、桃[9]、蘋果[10]、冬棗[11]果實的可溶性糖含量，但不同種類的有機(jī)肥對可溶性糖含量的影響存在差異[8]。甜瓜果實中積累的糖分主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖，而果實糖分含量的差異與糖代謝相關(guān)酶活性有關(guān)，包括蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)、蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS，合成與分解兩個方向)以及轉(zhuǎn)化酶[2]。馬慧等[12]研究發(fā)現(xiàn)，成熟的河套蜜瓜果實中SPS和SS 合成方向活性顯著高于樓蘭王果實，導(dǎo)致果實中蔗糖含量明顯高于樓蘭王果實；在高蔗糖積累型網(wǎng)紋甜瓜克利斯托成熟果實中SPS 活性高于低蔗糖積累型網(wǎng)紋甜瓜娜依托，而微蔗糖積累型花皮梢瓜成熟果實中蔗糖積累則與酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase，AI)活性降低有關(guān)，且不同發(fā)育時期果實糖分含量以及成熟果實不同部位糖分含量的差異均與果實中SPS活性、AI活性以及SS 凈活性(合成方向酶活性與分解方向酶活性差值)有關(guān)[13]。梨不同品種糖分含量存在差異，可以通過糖代謝相關(guān)酶活性高低及不同代謝酶種類相協(xié)調(diào)差異性來解釋這種現(xiàn)象[14]。關(guān)于蘋果的研究發(fā)現(xiàn)，適宜氮素用量可提高果實中果糖、蔗糖、葡萄糖的積累，而氮素過量(濃度＞0.3%)則導(dǎo)致其淀粉、果糖、蔗糖、葡萄糖的合成受到抑制，而淀粉代謝相關(guān)酶活性以及SPS、SS 合成方向活性以及AI活性也降低，且相關(guān)性顯著[15]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)改變有機(jī)肥料以及有機(jī)肥的用量并未提高甜瓜果實的糖含量，但能提高甜瓜產(chǎn)量[16-17]；同樣的，有機(jī)肥也未增加黃瓜果實中的糖含量[18]，Curuk 等[19]在甜瓜和西瓜中也得到了類似的結(jié)果。

有機(jī)肥部分替代或全部替代甜瓜生產(chǎn)中的化學(xué)氮肥，能否通過改變糖代謝相關(guān)酶活性進(jìn)而提高甜瓜中糖分的積累，還存在爭議。雞糞是一種比較優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥，其含有作物生長發(fā)育所需的中微量元素、有益生物活性菌及多種酶。因此，本研究以雞糞作為有機(jī)肥，替代化學(xué)氮肥以及與化學(xué)氮肥配施，以薄皮甜瓜DX108為試驗材料，探究雞糞、雞糞與尿素配施對甜瓜果實糖分積累以及糖代謝相關(guān)酶的影響，以期為甜瓜生產(chǎn)實際和理論研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

盆栽試驗采用基質(zhì)為草炭∶河沙=3∶1比例配置的混合基質(zhì)，每桶裝填10 kg 基質(zhì)。供試薄皮甜瓜為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝系甜瓜課題組繁育的DX108自交系品種(花后30～33 d 成熟)，采用穴盤進(jìn)行育苗，當(dāng)幼苗長出第4片真葉時，選取長勢基本一致、無病蟲害的幼苗定植于桶中，每桶定植1株甜瓜幼苗。

供試肥料為常規(guī)肥料:尿素(含N為46%)、磷酸二銨[含磷(P2O5)46.0%和含N 21.2%]、硫酸鉀[含鉀(K2O)34.3%]；試驗用雞糞為商品雞糞:含全氮1.46%，含磷(P2O5)0.74%，含鉀(K2O)0.75%，由黑龍江牧康牧業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置雞糞+尿素配施處理(A)、雞類處理(B)和對照(CK)3個處理，其中CK為化學(xué)肥料處理。施肥用量為尿素10 g/桶、磷酸二銨6.52 g/桶、硫酸鉀8.74 g/桶，肥料的用量為純N 600 mg·kg-1、P2O5300 mg·kg-1和K2O 300 mg·kg-1；A為純N 300 mg·kg-1+雞糞(純N 300 mg·kg-1)，各肥料用量為雞糞205 g/桶、尿素5.04 g/桶、磷酸二銨3.22g/桶、硫酸鉀4.26 g/桶；B量根據(jù)純N 600 mg·kg-1計算，為410 g/桶，其中包含磷(P2O5) 3.03 mg·kg-1，含鉀(K2O) 3.08 mg·kg-1，未添加磷酸二銨和硫酸鉀。在桶中填混合基質(zhì)時，CK 一半的氮磷鉀肥料以基肥的形式混合入土，其余肥料再平均分成兩份，分別在甜瓜植株伸蔓期和果實坐果后進(jìn)行追施；A和B 所用雞糞和磷鉀肥以及A的尿素，在裝填桶時與基質(zhì)混合均勻，裝入桶中。每個處理共18 桶，分3次重復(fù)，每個重復(fù)6 桶，隨機(jī)區(qū)組排列，置于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系實驗基地的塑料大棚中，各處理澆水、病蟲害防治均按照統(tǒng)一的管理方式進(jìn)行。甜瓜植株按照單蔓整枝方式進(jìn)行管理，子蔓結(jié)瓜，瓜前留1片葉進(jìn)行摘心。在甜瓜果實開花當(dāng)天進(jìn)行人工授粉，并掛標(biāo)簽標(biāo)記，在花后果實生長的第20、第25、第30、第35天采集甜瓜果肉樣品，置于-40℃冰柜貯藏，用于后續(xù)各項指標(biāo)的測定。

1.3 測定項目與方法

果糖、葡萄糖、蔗糖含量的測定:取1 g 凍樣，研磨后置于10 mL 離心管中，加入5 mL 80%乙醇溶液，80℃水浴30 min，冷卻后3 000×g離心10 min，收集上清液于50 mL 容量瓶中，重復(fù)以上步驟2次，合并上清液，將上清液定容至50 mL，即為3種糖的待測液。葡萄糖和果糖含量的測定采用蒽酮-硫酸比色法[20]；蔗糖含量的測定采用NaOH-蒽酮-硫酸比色法[20]。

酶活性的測定:取1 g 凍樣置于研缽中，加入少量石英砂和10 mL HEPES 緩沖液(包括50 mmol·L-1HEPES-NaOH，pH值7.5，1 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1MgCl2，2.5 mmol·L-1DTT，10 mmol·L-1MVC5%不溶性PVPP)，冰浴研磨成勻漿，4層紗布過濾后，12 000×g、4℃離心20 min，吸取全部上清液；然后向其中逐漸加入硫酸銨至80%溶解度，分多次加入以確保其充分溶解，冰上放置15 min 后，12 000×g、4℃離心30 min，棄掉上清液，用3 mL 緩沖液溶解沉淀，并轉(zhuǎn)移至透析袋中，置于4℃冰箱，用稀釋10倍的提取緩沖液(不含PVPP)透析20 h，透析液為待測液。SPS、SS(合成和分解方向)以及AI和中性轉(zhuǎn)化酶(neutral invertase，NI)活性測定參考李志凌[14]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010和SPSS.19 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計分析，采用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析；采用Origin 8.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理下甜瓜果實葡萄糖、蔗糖、果糖含量變化

由圖1可知，不同施肥處理對甜瓜果實葡萄糖、蔗糖、果糖含量的影響存在明顯差異，尤其在果實成熟期。隨著甜瓜果實的發(fā)育，葡萄糖、蔗糖和果糖積累發(fā)生變化，CK 甜瓜果實中葡萄糖、果糖的含量呈先升高后降低的趨勢，其果實葡萄糖和果糖含量最高分別為58.48 mg·g-1(花后30 d)和62.74 mg·g-1(花后25 d)；A和B的葡萄糖、果糖含量呈不斷增加的趨勢，在生長發(fā)育后期(花后35 d)，A和B 甜瓜果實中的葡萄糖和果糖含量明顯高于CK，尤其葡萄糖含量表示出顯著性差異(P＜0.05)。與CK相比，在花后35 d，A和B果實中蔗糖含量顯著增加84%以上(P＜0.05)，而B成熟果實中蔗糖含量較A 果實顯著提高了18.7%(P＜0.05)。說明在生產(chǎn)中利用雞糞有機(jī)肥全部替代或部分替代化學(xué)氮肥能夠提高甜瓜果實中的葡萄糖、蔗糖和果糖含量，進(jìn)而改變果實甜度。

圖1 不同施肥處理對葡萄糖、蔗糖和果糖含量的影響Fig.1 Effects of different fertilization treatments on glucose，sucrose and fructose content

2.2 甜瓜果實蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶活性變化

在果實生長發(fā)育過程中，A和B 甜瓜果實中SPS活性變化趨勢基本一致，均呈升高趨勢(圖2-A)，且在花后35 d 達(dá)到最大值，分別為36.25 μmol·h-1·g-1和40.28 μmol·h-1·g-1?；ê?0～35 d，CK 果實中SPS活性基本處于平緩變化狀態(tài)，且顯著低于A和B(P＜0.05)。

甜瓜果實中SS 活性變化分為合成和分解兩個方向。由圖2-B可知，花后20～35 d 所有處理的甜瓜果實SS 合成方向酶活性的變化趨勢基本一致，呈先上升而后降低的趨勢。隨著甜瓜果實的發(fā)育，花后30 d時，A和B 果實中SS 合成方向酶活性均達(dá)到最大值，分別為52.03 μmol·h-1·g-1和45.24 μmol·h-1·g-1，均顯著高于CK(P＜0.05)；A 果實SS 合成方向酶活性顯著高于B 果實(P＜0.05)。

由圖2-C可知，花后20～35 d，A和B 甜瓜果實中SS 分解方向酶活性均呈先略升高后降低趨勢；CK 果實中SS 分解方向酶活性呈下降趨勢，且后期下降緩慢，而A、B 果實中SS 分解方向酶活性在花后25 d 后迅速下降，均在花后35 d 達(dá)最低值?；ê?0～35 d，B與CK 果實中SS 分解方向酶活性無顯著差異(P＞0.05)，而花后35 d時，A 果實中該酶活性(27.89 μmol·h-1·g-1)明顯高于B(20.27 μmol·h-1·g-1)和CK(20.78 μmol·h-1·g-1)，但差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 不同施肥處理下甜瓜果實轉(zhuǎn)化酶活性變化(酸性和中性轉(zhuǎn)化酶活性)

在甜瓜果實中AI活性隨著果實發(fā)育整體呈降低趨勢(圖3-A)?；ê?0 d之后，甜瓜果實中AI活性迅速下降至最低(花后25 d)，且A 與B之間無顯著差異，但顯著高于CK(P＜0.05)。花后25 d之后，A和B果實中AI活性呈先升高后降低的趨勢，但CK 果實中AI活性基本穩(wěn)定。此外，花后25～35 d，B 果實中AI活性始終顯著高于A(P＜0.05)。

由圖3-B可知，各處理甜瓜果實中NI活性在花后20～35 d 變化趨勢基本一致，隨著果實發(fā)育，NI活性逐漸升高，處理之間存在差異。CK 甜瓜果實中NI活性變化緩慢且增幅較小，而A和B 果實中NI活性變化幅度明顯大于CK，且在花后20 d之后，A和B 果實中NI活性均顯著高于CK(P＜0.05)?；ê?0～35 d，B 果實中NI活性顯著高于A 果實(P＜0.05)。

圖2 不同施肥處理對甜瓜果實蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性的影響Fig.2 Effects of different fertilization treatments on SPS and SS activity in melon fruit

圖3 不同施肥處理對甜瓜果實酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶活性的影響Fig.3 Effects of different fertilization treatments on AI and NI activity in melon fruit

3 討論

甜瓜屬于喜肥的作物，在植株營養(yǎng)生長和甜瓜果實生長發(fā)育期間對氮、磷、鉀肥的需求較高，尤其是氮肥和鉀肥[5，21]。此外，瓜果類蔬菜作物的產(chǎn)量和品質(zhì)除了受品種的影響外，還與施肥有關(guān)[4，6，8]。設(shè)施栽培中，生產(chǎn)者為了追求產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，化學(xué)氮肥的施用量一直處于過量狀態(tài)，導(dǎo)致肥料的利用率較低[4，8，22]。研究表明在一定氮肥施用量范圍內(nèi)，甜瓜的產(chǎn)量增加，但氮肥施用過量會導(dǎo)致甜瓜的產(chǎn)量和可溶性糖含量明顯降低[1，8，23]。諸多研究表明，有機(jī)肥全部或部分替代化學(xué)氮肥能提高瓜果類蔬菜的可溶性糖含量[6-10]。在本試驗條件下，花后25～35 d，A、B 甜瓜果實中蔗糖、葡萄糖含量均顯著高于相同施氮量的CK(P＜0.05)，且A 優(yōu)于B，尤其是成熟果實中。這與前人在蘋果中的研究結(jié)果基本一致[10]，但與其他學(xué)者在甜瓜中的研究結(jié)果相反[16，19]。其原因有可能是有機(jī)肥種類以及有機(jī)肥與化學(xué)氮肥的配施比例不同，對土壤理化性質(zhì)、植物根系分泌物、植物對氮素的吸收代謝調(diào)節(jié)等作用存在差異，導(dǎo)致了果實糖積累不同[24-28]。此外，前人對扁豆研究也發(fā)現(xiàn)，等氮量下，雞糞與尿素配施通過調(diào)控根系分泌物的改變和土壤微生物數(shù)量增加及組分的變化，促進(jìn)了扁豆可溶性糖含量的增加[29]。但是有機(jī)肥種類以及有機(jī)肥與化學(xué)氮肥的配施影響果實糖積累差異的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

甜瓜果實糖分積累與蔗糖代謝相關(guān)酶之間的協(xié)同調(diào)控相關(guān)[12，14，16]。在蘋果中，氮肥的過量施用(氮肥濃度＞0.3%)抑制了蘋果果實中淀粉代謝酶、SPS、SS合成方向以及AI活性，進(jìn)而降低了果實中可溶性糖含量[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，A、B、CK 3種處理甜瓜果實中SPS、SS 合成方向和分解方向、AI、NI活性均表現(xiàn)出相似的變化趨勢，但A、B 顯著提高了花后20～35 d 果實中大部分代謝酶的活性。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CK 甜瓜果實蔗糖積累與AI活性呈顯著負(fù)相關(guān)，葡萄糖與SPS和SS 合成方向酶活性呈顯著正相關(guān)，而A、B 甜瓜果實中蔗糖、葡萄糖和果糖積累(除B 中葡萄糖)均與SPS、NI活性呈顯著正相關(guān)；A 甜瓜果實中蔗糖、葡萄糖和果糖積累均與SS 分解方向酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，而B 甜瓜果實中蔗糖積累與SS 分解方向酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(表1)。由此可知，雞糞主要通過影響SPS、NI、SS(分解方向)之間的相互協(xié)調(diào)進(jìn)而調(diào)控甜瓜果實中糖分積累。甜瓜中糖分含量隨著化學(xué)氮素濃度的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢[3]，可能與氮素過量條件下抑制SPS、SS 合成酶活性有關(guān)[28]。而本研究中，雞糞與尿素配施可能緩解了化學(xué)氮肥對果實中SPS、SS合成方向酶活性的抑制作用，從而促進(jìn)了甜瓜果實糖的積累，但其調(diào)控機(jī)理尚不明確。甜瓜果實糖的代謝是一個復(fù)雜的生理代謝過程[30-31]，有多種酶參與糖的合成和代謝[32]，存在于不同細(xì)胞器中的糖轉(zhuǎn)運蛋白也參與了糖的轉(zhuǎn)運與積累[33]。大量研究表明，有機(jī)肥以及有機(jī)肥與化學(xué)氮肥配施與純施化學(xué)氮肥相比，提高了土壤酶活性、土壤養(yǎng)分有效性，并改變了其腐殖質(zhì)組成及含量，同時改善了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了土壤的供肥性能，促進(jìn)了作物生長并提高了果實品質(zhì)[23，28，34-36]，可能是通過氮素信號、糖信號以及激素信號傳遞，調(diào)控了植物-土壤-微生物這樣的互作系統(tǒng)，開啟了果實中糖代謝途徑“開關(guān)”基因，改變了果實糖代謝途徑，促進(jìn)了糖分在細(xì)胞中的運輸、轉(zhuǎn)化以及積累的改變，從而導(dǎo)致了甜瓜果實中可溶性糖含量以及糖分含量的差異，但該推測還需利用分子生物學(xué)的手段進(jìn)一步驗證。

表1 果實糖組分與相關(guān)代謝酶活性的相關(guān)系數(shù)Table1 Correlation coefficients between sugar contents and related enzyme activity in melon fruit

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，利用雞糞替代或部分替代尿素調(diào)節(jié)了甜瓜果實中蔗糖、葡萄糖、果糖的積累，提高了花后25～35 d 果實中蔗糖、葡萄糖的含量以及花后30～35 d 果實中果糖的含量，尤其是花后35 d 成熟果實中這3種糖含量顯著高于純化學(xué)氮肥處理果實。此外，化學(xué)肥料處理甜瓜果實中糖分積累與SPS和AI活性相關(guān)，而雞糞部分替代處理果實中糖分積累以及雞糞全部替代處理果實中蔗糖積累與SPS、NI活性呈顯著或極顯著正相關(guān)，與SS 分解方向酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，而雞糞全部替代處理果實中果糖積累與SPS、NI活性呈顯著正相關(guān)，推測雞糞的施用引起糖代謝過程中這幾種酶之間的相互協(xié)調(diào)關(guān)系發(fā)生了變化，進(jìn)而導(dǎo)致務(wù)施肥處理果實對蔗糖、葡萄糖、果糖積累產(chǎn)生了差異。但是，本研究無法解釋雞糞的施用如何啟動甜瓜果實糖代謝途徑中的“開關(guān)”基因，進(jìn)而影響了代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性變化以及糖分的運輸與分配。因此，還需從分子生物學(xué)的角度進(jìn)一步明確有機(jī)氮調(diào)控植物體內(nèi)氮信號、糖信號以及激素信號的級聯(lián)系統(tǒng)，進(jìn)而探究影響甜瓜果實糖代謝、運輸及分配的分子機(jī)理。