王林葉 吉冰璇 曾彥達 張啟軍 張美萍 呂川根

(1山西師范大學生命科學學院，山西 臨汾 041004；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所，江蘇 南京 210014)

人類大量使用氯氟烴等物質使大氣的臭氧層逐漸變薄，到達地面的UV-B(280～320 nm)輻射增強，對人類活動、動植物和微生物生長造成了嚴重影響[1-4]。增強UV-B輻射會造成植物的DNA 損傷[5-7]、生理生化過程發(fā)生紊亂[8-12]、生長受阻并最終降低產(chǎn)量[13-16]。光氧化現(xiàn)象在水稻中普遍存在，早稻苗期長期處于低溫陰雨天氣之后突然轉晴，或者生育后期長期陰雨天氣后突然轉晴，亦或晚稻生育后期遭遇冷空氣侵襲后轉晴，這類天氣都極易引發(fā)水稻光氧化現(xiàn)象[17]。水稻發(fā)生光氧化會導致葉片失綠(黃化)甚至死亡，從而影響稻谷產(chǎn)量[18]。水稻光氧化突變體812HS 來源于一個普通水稻不育系812S(野生型)，兩者農(nóng)藝性狀基本相同，在幼苗期兩者的葉色表型基本無差異，但在低溫寡照的江南梅雨季節(jié)過后、田間自然光照明顯增強的情況下，812HS的葉片表現(xiàn)出明顯的失綠現(xiàn)象，其野生型812S的表型并無明顯變化，而在光強中等或較弱時，812HS的整體葉色又可恢復為正常綠色[19]。研究表明，812HS是研究水稻葉片光氧化特性的好材料，其光氧化特性由一個新基因LPO控制[20]。812HS的光氧化現(xiàn)象由強光引起，增強UV-B輻射是否會加劇對812HS或其他光氧化水稻葉色表型的影響，影響程度是否強于普通水稻等，目前鮮見相關報道。因此，本試驗以812HS為材料，以其野生型812S 代表普通水稻，研究UV-B 增強輻射對812HS的光合生理及生長的影響，旨在為水稻光氧化現(xiàn)象研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及其培養(yǎng)

以水稻光氧化株系812HS(突變體)為試驗材料，以其野生型812S 代表普通水稻(對照)。于2018年5-8月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所(32°03′N、118°47′E)進行盆栽試驗。盆缽直徑20 cm，高25 cm。水稻種子經(jīng)浸種、催芽后直播于盆缽，每個處理重復6次(盆)。三葉期留取生長狀況基本一致的幼苗，每盆3 穴，每穴1 苗，采用常規(guī)水肥管理。

1.2 輻射處理

設置2個處理組，即增強UV-B輻射處理和自然光對照。增強UV-B輻射下生長的812HS 記為L1，812S 記為L2。自然光條件下生長的相應對照812HS記為CK1，812S 記為CK2。在室外自然條件下，將UV-B 燈管等距離水平懸掛于水稻植株上方，通過調(diào)節(jié)UV-B 燈架與植株頂端間的距離來控制輻射劑量，采用40 kJ·m-2·d-1劑量[相當于增強本地自然光中UV-B輻射量的40%左右，用XP-4000 紫外強度計(上海遂歐儀器有限公司)核定]的UV-B輻射處理，每天白天處理9 h(陰雨天除外)，共計處理65 d。

1.3 水稻各項指標的測定方法

1.3.1 葉綠素含量的測定 分別于幼苗期、分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期使用SPAD-502Plus SPAD 儀(常州德圖精密儀器有限公司)測定距葉尖三分之一處的葉綠素含量。每個處理測定10 張葉片，取平均值。

1.3.2 灌漿期葉綠素合成代謝中間產(chǎn)物

1.3.2.1 5-基乙酰丙酸含量的測定 參照王凌健等[21]的方法并略加改動。準確稱取0.5 g 葉片并用液氮研磨，按照1∶5的體積比加入4%三氯乙酸充分研磨成漿并定容至20 mL，8 000×g離心5 min；取1 mL 上清液加入0.5 mL 1 mol·L-1醋酸鈉和50 μL 乙酰丙酮，充分搖勻后100℃水浴10 min，放置室溫冷卻后于8 000×g離心5 min，取1.5 mL 上清液加入1.5 mL Ehrlich-Hg 顯色劑(取2 g 對-二甲氨基苯甲醛加入60 mL 冰醋酸，再加入16 mL 高氯酸，用冰醋酸定容至100 mL，最后加入0.3 g 氯化汞)，暗處理15 min 后用GS54 紫外可見分光光度計(上海棱光技術有限公司)測定553 nm 波長處的OD值。5-基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)含量以553 nm的消光系數(shù)7.2×104L·mol-1·cm-1計算。

1.3.2.2 膽色素原含量的測定 參照Bogorad[22]的方法。稱取0.5 g 葉片，用液氮充分研磨，加入5 mL緩沖液(0.1 mol·L-1EDTA、0.6 mol·L-1Tris，pH值8.2)，于12 000×g條件下離心10 min。取上清液2 mL，加入2 mL Ehrlich-Hg 顯色劑，暗處理15 min 后用紫外可見分光光度計測定553 nm 波長處的OD值。膽色素原(porphobilinogen，PBG)含量以553 nm的消光系數(shù)6.1×104L·mol-1·cm-1計算。

1.3.2.3 尿卟啉原Ⅲ含量的測定 參照Bogorad[22]的方法。稱取1 g 葉片，加入液氮研磨后再加入10 mL 0.067 mol·L-1PBS 緩沖液(pH值6.8)研磨成漿，12 000×g離心10 min。吸取5 mL 上清液，加入0.25 mL 1%Na2S2O3，漩渦震蕩并用強光照射20 min，然后用1 1 mol·L-1冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，用8 mL 乙醚反復萃取3次，測定水相在405.5 nm 波長處的OD值；乙醚萃取液合并后用3 mL 0.1 mol·L-1鹽酸萃取，測定鹽酸相在395.5 nm 處的OD值。尿卟啉原Ⅲ(urogenⅢ)含量以消光系數(shù)5.48×105L·mol-1·cm-1計算。

1.3.2.4 原卟啉Ⅸ、鎂原卟啉Ⅸ和原脫植基葉綠素含量的測定 參照Hodgins 等[23]的方法。準確稱取0.3 g 葉片，加入25 mL 80%堿性丙酮，充分研磨后于4℃條件下15 000×g離心15 min，吸取上清液后分別在575、590和628 nm 波長處測定OD值。原卟啉Ⅸ(ProtoⅨ)、鎂原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)和原脫植基葉綠素(Pchlide)含量計算公式如下:

1.3.3 葉綠素a 熒光誘導動力學參數(shù)的測定 按照Strasser 等[24]的方法，使用HandyPEA 連續(xù)激發(fā)式熒光儀(Hansatech，英國)測量葉綠素a 熒光誘導動力學參數(shù)。用夾子夾住水稻葉片，暗處理20 min 后用光量子為3 000 μmol·m-2·s-1的飽和紅閃光照射，儀器自動記錄相應數(shù)據(jù)，采用PEA Plus Hansated 軟件計算和分析數(shù)據(jù)。每個處理測量6 張葉片，取平均值。

1.3.4 分蘗數(shù)、有效分蘗數(shù)和株高的測定 每個處理隨機選取12株水稻，計數(shù)分蘗數(shù)和有效分蘗數(shù)，取平均值；測量每個植株基部至穗頂部的高度，以平均值作為株高。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 應用Microsoft Office Excel 2017和SPSS 21.0 對數(shù)據(jù)進行分析和處理。采用t檢驗方法、單因素方差分析和Duncan’s 多重比較進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 增強UV-B輻射對水稻葉綠素含量的影響

由圖1可知，L1和L2的葉綠素含量變化趨勢基本一致，在分蘗期至抽穗期均上升，在抽穗期和灌漿期均下降。與相應的CK1和CK2相比，L1和L2的葉綠素含量在分蘗期均顯著減少(P＜0.05)，L1的降幅顯著低于L2(少降4.7個百分點，P＜0.05)。生長中后期，812HS的葉綠素含量優(yōu)勢更明顯，在抽穗期，相比于L2的無變化(與CK2 比)，L1 則顯著提高了15.3%(與CK1 比)(P＜0.05)；在灌漿期，L1 較CK1 顯著增加了48.7%(P＜0.05)，比L2的增幅(與CK2 比)多34.4個百分點，差異極顯著(P＜0.01)。

圖1 增強UV-B輻射對水稻葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of enhanced UV-B radiation on the chlorophyll content of rice

2.2 增強UV-B輻射對水稻灌漿期葉綠體合成代謝中間產(chǎn)物的影響

由圖2-A、E可知，增強UV-B輻射后，與CK1相比，L1 膽色素原含量降低了29.7%，而原卟啉Ⅸ含量增加了38.2%，導致灌漿期葉綠素含量仍然增加。由圖2-B、C、D、F可知，其他指標均無顯著變化。上述結果表明，增強UV-B輻射使812HS 在灌漿期的原卟啉Ⅸ的合成量增多，導致葉綠素含量增加，

由圖2-B可知，增強UV-B輻射后，在葉綠素生物合成過程中，與CK2相比，L2的原脫植基葉綠素含量增加了55.4%。由圖2-A、C、D、E、F可知，其他指標均無顯著變化。上述結果表明，原脫植基葉綠素含量的增加會導致L2 葉綠素含量增加。

綜上，增強UV-B輻射會影響812HS 在葉綠素的生物合成過程中的膽色素原、原卟啉Ⅸ的合成，以及普通水稻中原脫植基葉綠素的合成。

2.3 增強UV-B輻射對葉綠素a 熒光參數(shù)的影響

2.3.1 增強UV-B輻射對PSⅡ光合性能的影響 由圖3可知，L1 與L2的Fv/Fm值變化趨勢基本一致。與自然光生長相比，在拔節(jié)期，L1的Fv/Fm值降低3.9%(P＜0.05)，同時，F(xiàn)O增加11.6%，F(xiàn)m降低9.6%；在灌漿期，L1的Fv/Fm值基本無變化，而L2 增加了4.9%(P=0.03)，同時，L2的FO降低22.4%，F(xiàn)m降低11%。以上結果說明，增強UV-B輻射后，812HS和812S的PSⅡ原初光能轉化效率均降低。812HS的光合反應中心在拔節(jié)期遭到破壞，出現(xiàn)光抑制，而812S 則在灌漿期天線色素降解，光合反應中心失活，其PSⅡ原初光能轉化效率卻升高，這可能與葉綠素含量增加有關。

由圖3-A可知，L1 與L2的Fv/Fm值均在幼苗期至拔節(jié)期下降，拔節(jié)期至抽穗期升高，灌漿期又下降。與自然光生長相比，L1 分蘗期的Fv/Fm值顯著增加3.2%(P＜0.05)，較L2的增幅高1.8個百分點，但差異不顯著；在拔節(jié)期，L1的Fv/Fm值顯著降低3.9%，較L2 降幅多1.4個百分點(P＞0.05)；在灌漿期，L1的Fv/Fm值基本無變化，而L2 顯著增加了4.9%(P＜0.05)。綜上說明，增強UV-B輻射提高了812HS 分蘗期PSⅡ原初光能轉化效率，且比812S 提高效率更明顯，但降低了其在拔節(jié)期和灌漿期的PSⅡ原初光能轉化效率。

由圖3-B可知，L1 與L2的FO值變化趨勢基本一致，幼苗期至拔節(jié)期升高，拔節(jié)期至抽穗期下降，隨后又升高。在拔節(jié)期，L1的FO值與CK1相比增加了11.6%，而L2 與CK2相比無明顯變化，表明L1的PSⅡ光合結構被破壞或者發(fā)生可逆失活，導致原初光化學效率下降。在灌漿期，L1的FO值與CK1 間無明顯差異，而L2 較CK2 顯著增加了22.4%，說明812HS的天線色素不受影響，而普通水稻的天線色素明顯降解。

由圖3-C可知，L1和L2的Fm值在幼苗期和分蘗期均上升，隨后，L1 表現(xiàn)相對穩(wěn)定狀態(tài)，而L2 有繼續(xù)平穩(wěn)上升的趨勢；在抽穗期，L1的Fm值顯著降低9.6%，而L2 無顯著差異；在灌漿期，L1 無顯著差異，但L2 顯著降低11%，表明812HS 在抽穗期出現(xiàn)了光抑制，而812S 則在灌漿期出現(xiàn)光抑制。

2.3.2 增強UV-B輻射對熒光動力學曲線的影響 由圖4-A、B可知，與自然光生長相比，2個水稻的OJIP曲線在分蘗期和拔節(jié)期J-Ⅰ相均降低，表明快還原型庫PQ 遭到破壞，電子從QA-向QB-傳遞過程受阻，光合結構被破壞或者發(fā)生可逆失活。由圖4-C可知，在抽穗期，2個水稻的OJIP 曲線均無明顯變化；在灌漿期，與自然光生長相比，L1的熒光動力學曲線無顯著變化，而L2的O、J、Ⅰ、P 點均下降，PSⅡ的電子傳遞受到抑制(圖4-D)。

圖2 增強UV-B輻射對水稻葉綠素合成中間代謝產(chǎn)物的影響Fig.2 Effects of enhanced UV-B radiation on intermediate metabolites of chlorophyll synthesis in rice

上述結果表明，增強UV-B輻射后，812HS 在拔節(jié)期的葉綠素熒光誘導曲線(OJIP)受到影響，其快還原型庫PQ 遭到破壞，電子從QA-向QB-傳遞過程受阻，而812S 則在拔節(jié)期和灌漿期均受影響，光合結構被破壞或者發(fā)生可逆失活。

2.4 增強UV-B輻射對水稻生長特性的影響

由圖5可知，與自然光生長相比，2個水稻的分蘗數(shù)和有效分蘗數(shù)均減少，株高均降低。L1的分蘗數(shù)、有效分蘗數(shù)和株高分別下降10.0%、16.3%、12.9%，其中株高的降幅較L2(14.6%)少2.0個百分點，兩者差異顯著(P＜0.05)。表明增強UV-B輻射使812HS和812S的生長量均降低，但812HS 受到的傷害較812S 輕，說明增強UV-B輻射812HS 農(nóng)藝性狀的影響弱于812S。

圖3 增強UV-B輻射對水稻PSⅡ光合性能的影響Fig.3 Effect of enhanced UV-B radiation on PSⅡphotosynthetic properties of rice

3 討論

植物的形態(tài)、生理特征和生長量的變化可準確反映外界環(huán)境的影響，UV-B輻射的影響最終體現(xiàn)在植物的生長上，且因植物品種的不同和輻射劑量的大小而異，不同品種或者同一品種在不同發(fā)育時期對UV-B輻射敏感度也有不同[25-26]。增強UV-B 抑制水稻生長，使植株分蘗數(shù)、有效分蘗數(shù)減少，植株矮化[27-29]。本試驗中，增強UV-B輻射65 d 后，812HS和812S的分蘗數(shù)和有效分蘗數(shù)均減少，植株均矮化，2個品種的分蘗數(shù)和有效分蘗數(shù)降幅無顯著差異，但812HS株高的降幅顯著小于812S，表明增強UV-B輻射對光氧化水稻812HS 生長的抑制程度弱于普通水稻。唐莉娜等[30]研究表明，增強UV-B輻射抑制水稻生長，使株高變矮，分蘗數(shù)減少，本研究與此結論一致。

光合作用與植物的生長和發(fā)育密切相關，光合作用的物質基礎是葉綠素，其含量高低直接影響植物對光能的吸收和傳遞。本研究中，增強UV-B輻射后，812HS的葉綠素含量在分蘗期顯著減少，抽穗期后顯著增加，尤其是在灌漿期，其增幅較普通水稻高，可能是植株幼嫩葉片(分蘗期)突然遭受UV-B輻射時葉綠素合成受阻，隨后，植株逐漸適應了UV-B輻射并啟動了某些機制，如葉綠素生物合成中增強UV-B輻射使得812HS 分蘗期的PSⅡ原初光能轉化效率(Fv/Fm)提高，在拔節(jié)期有所降低，這與普通水稻無差別，但812HS光合特性在灌漿期不受顯著影響，而普通水稻的FO和Fm均降低，這可能與光合作用相關的其他一些因子受到影響有關，如內(nèi)源激素等[31]，此方面尚有待進一步深入研究。812HS 拔節(jié)期Fv/Fm值降低。FO值升高，F(xiàn)m降低，同時J-Ⅰ相降低，說明電子從向的傳遞過程受阻，快還原型PQ 庫遭到破壞，使得PQs和PSI 蛋白復合體失活。這與喬媛等[32]的研究結果一致。而增強UV-B輻射對812S 生長的抑制程度更強，其天線色素含量降低，光合結構被破壞或者發(fā)生可逆失活，在灌漿期OJIP 曲線整體下降，發(fā)生光損傷、光抑制、光氧化，這種現(xiàn)象在光氧化水稻812HS中并不明顯。周黨衛(wèi)等[33]曾報道，增強UV-B輻射會降低葉片的光合色素。但本研究結果表明，增強UV-B輻射并不會明顯降低光氧化水稻812HS的天線色素。具體原因尚有待深入研究。

圖4 增強UV-B輻射對水稻OJIP 曲線的影響Fig.4 Effect of enhanced UV-B radiation on OJIP curve of rice

圖5 增強UV-B輻射對水稻生長特性的影響Fig.5 Effect of enhanced UV-B radiation on growth characteristic of rice

4 結論

增強UV-B輻射對光氧化水稻812HS和普通水稻均有不利影響，但對光氧化水稻812HS的光合作用損傷和生長抑制程度弱于普通水稻。造成傷害的主要原因是快還原型PQ 庫遭到破壞，PQf和QB蛋白復合體失活，導致光合能力下降。本研究結果為夏季強光下的作物栽培和強光防護設施栽培提供了一定的理論參考。