田愛梅 于 暉

(1西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065；2浙江大學(xué)蔬菜研究所，浙江 杭州 310058)

芥藍(lán)(Brassica alboglabraL.H.Bailey)十字花科蕓薹屬一年生草本植物，其味道鮮美，含有豐富的維生素A、維生素C、維生素E 及礦物質(zhì)、類胡蘿卜素和酚類化合物、纖維素、糖類等，是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的功能型蔬菜。此外，芥藍(lán)還含有豐富的硫苷，硫苷在植物防御反應(yīng)、特殊風(fēng)味形成和抗癌等方面具有特殊作用，因而，芥藍(lán)是蔬菜中公認(rèn)的抗癌能手之一[1-4]。

纖維素是植物細(xì)胞壁初生壁和次生壁的主要組成成分，由細(xì)胞膜外側(cè)的“纖維素合成酶”合成?！袄w維素合成酶”包括纖維素合成酶(cellulose synthase，CesA)家族和和類纖維素合酶(cellulose synthase-like protein，CSL)家族[2]。其中，類纖維素合酶包含有典型的β-糖基轉(zhuǎn)移酶，它們可能催化多聚糖(半纖維素的骨架)的合成。類纖維素合酶被劃分為9個(gè)亞家族(CslA～CslH和CslJ)，其中CSLD與纖維素合酶基因具有高度的序列相似性，表明該亞家族基因在植物生長發(fā)育過程中參與了纖維素或半纖維素的合成[5-6]。目前，研究者已在水稻[7]、擬南芥[8]、楊樹[9]中證實(shí)幾個(gè)類纖維素合酶也直接參與纖維素的生物合成。前人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同纖維素合酶可能參與不同細(xì)胞壁層纖維素的合成[10-12]，但纖維素合酶確切的生物學(xué)功能尚不明確[13-15]。目前已在多種植物中克隆到類纖維素合成酶基因，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)6個(gè)CSLD，玉米中發(fā)現(xiàn)5個(gè)，水稻中發(fā)現(xiàn)5個(gè)[16-18]，但在芥藍(lán)中鮮見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以芥藍(lán)為材料，在克隆類纖維素合成酶基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)行序列分析和表達(dá)研究，以期為該基因功能的驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

芥藍(lán)(白花芥藍(lán))，種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)張恩慧老師惠贈(zèng)。芥藍(lán)栽植于西安文理學(xué)院溫室大棚，定植75～85 d 后于花期分別采集葉、花莖、各級花蕾[一級(dm＜2.2 mm)；二級(2.2 mm＜dm＜3.4 mm)；三級(dm＞3.4 mm)]、開放的花和嫩角果，用錫箔紙包好并標(biāo)記，迅速放入液氮中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA合成 植物總RNA的分離根據(jù)TIANGEN 公司(北京)RNA 提取試劑盒的方法進(jìn)行。cDNA 第一鏈的合成按照cDNA Synthesis Kit Manual(TIANGEN，北京)進(jìn)行。

1.2.2 芥藍(lán)BaCSLD的克隆 采用DNAMAN 6.0 軟件對同源基因序列進(jìn)行比對分析，設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物P1:5′-ATGGAGAGGAGGTTATCCGTG-3′，下游引物P2:5′-TCACACCGAGAATCCTCCACCG-3′。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以芥藍(lán)cDNA為模板，用Taq 聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(20 μL):cDNA 模板(20 mg·L-1) 1 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、2×Taq PCR Master mix 12 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)32次；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠檢測，切膠、回收后連接于T 載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5a 中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR檢測后將陽性克隆交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建為了解BaCSLD在進(jìn)化過程中的分化情況，選取常見農(nóng)作物及模式植物(表1)為代表[17]，通過DNAMAN 8和在線工具h(yuǎn)ttp:/ /web.expasy.org 推導(dǎo)BaCSLD編碼的蛋白序列及特征；根據(jù)已經(jīng)分離的BaCSLD核苷酸序列，用Clustal X 2.1 軟件比對CSLD 及其同源序列(表1)；采用Mega 6.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，建樹方法為最大簡約法(maximum parsimony，MP)。

表1 系統(tǒng)進(jìn)化樹中各基因名稱對應(yīng)的物種及序列號Table1 The species and genbank accession numbers corresponding to each gene name in phylogenetic tree

1.2.4BaCSLD的亞細(xì)胞定位 以pT::BaCSLD 陽性質(zhì)粒DNA為模板，借助亞細(xì)胞定位引物5′-CGGGAT CCATGCAGAGAGAGCACCGAC-3′和5′-TCCCCCGGG CTAAAAGAGATCAAGAATTTCTGAA-3′，使用南京諾唯贊生物科技有限公司的高保真酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)SmaⅠ和BamHI 限制性內(nèi)切酶雙酶切并膠回收純化后的BaCSLDCDS片段，利用T4 DNA 連接酶，構(gòu)建到亞細(xì)胞定位載體PGFC-eGFP 上，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，并進(jìn)行菌液PCR、酶切和測序驗(yàn)證。將轉(zhuǎn)入PGFC-eGFP::BaCSLD 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101 活化，挑取單菌斑加入含50 mg·L-1Kan、50 mg·L-1Str和50 mg·L-1Rif的3種抗生素的LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。取1 mL 培養(yǎng)液至含20 mL 50 mg·L-1Kan、50 mg·L-1Str和50 mg·L-1Rif的3種抗生素的LB 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。收集菌體后用LB 空白培養(yǎng)基將菌液濃度重懸至0.8(OD600)，將篩選好的陽性質(zhì)粒PGFC-eGFP::BaCSLD和空載質(zhì)粒35S::GFP 分別轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101，選取生長2～4 周的本生煙植株，選擇葉片長度為2個(gè)指節(jié)的平整的葉片注射。將侵染液室溫下放置2～3 h 后注射煙草葉片(避開煙草葉脈)。暗培養(yǎng)1～2 d 后，于FV3000型激光共聚焦顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)下觀察亞細(xì)胞定位情況。

1.2.5BaCSLD的時(shí)空表達(dá)分析 總RNA 提取與cDNA 第一鏈合成同1.2.1。采用UBQ10 作為參照，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)RT-PCR 引物，上游P1:5′-GCATTA GATGGGTTACAAGG-3′，下游P2:5′-TACCAGCAAGAA ATGACAGC-3′。PCR 反應(yīng)體系:Taq 聚合酶mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。PCR 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s；72℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min，4℃保存。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 BaCSLD 序列特征分析

根據(jù)同源序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增了BaCSLDcDNA 序列2 817 bp(圖1)。通過DNAStar 軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因序列無內(nèi)含子，包含一個(gè)2 796 bp的完整開放閱讀框，編碼931個(gè)氨基酸，該基因編碼的氨基酸序列分子量為104.98 kDa，含有103個(gè)酸性氨基酸(D、E)，101個(gè)堿性氨基酸(K、R)，354個(gè)疏水氨基酸(A、Ⅰ、L、F、W、Ⅴ)，以 及202個(gè) 極 性 氨 基 酸(N、C、Q、S、T、Y)。經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 同源性比對，發(fā)現(xiàn)BaCSLD1 (Brassica oleraceavar.oleraceacellulose synthase-like protein D1)序列與甘藍(lán)類纖維素合成酶(Accession:XM ＿ 013781242) 具有99%的相似性。推測BaCSLD1是類纖維素合成酶家族的成員之一。

圖1 CDS 基因全長DNA的擴(kuò)增Fig.1 Amplication products of BaCSLD gene full-length cDNA

2.2 BaCSLD 編碼蛋白的特征

經(jīng)在線數(shù)據(jù)庫http:/ /www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 分析，BaCSLD屬于跨膜蛋白，具有8個(gè)跨膜區(qū)(圖2)。蛋白質(zhì)專家分析系統(tǒng)(http:/ /ca.expasy.org)分析表明，它們都具有多個(gè)活性位點(diǎn)，包括酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)、依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)、?；稽c(diǎn)、蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)；在線數(shù)據(jù)庫http:/ /smart.Embl-heidelberg.de/smart/job＿status 分析發(fā)現(xiàn)，BaCSLD 蛋白具有celluse-synt 結(jié)構(gòu)域。

圖2 BaCSLD 跨膜區(qū)預(yù)測Fig.2 Prediction of transmembrane region of BaCSLD

2.3 BaCSLD 同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

利用系統(tǒng)發(fā)育軟件MEGA5.0 對13種植物材料的CSLD 同源序列進(jìn)行比對分析，構(gòu)建MP 系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖3可知，BaCSLD 同源序列與擬南芥AtCSLD親緣關(guān)系較近，其次為苦瓜中的McCSLD，而與同屬的油菜中的BnCSLD和蕪菁中的BrCSLD 關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 BaCSLD 亞細(xì)胞定位分析

為了確定BaCSLD編碼蛋白在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位，進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析。將測序正確的PGFCeGFP::BaCSLD載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草體內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)法導(dǎo)入煙草表皮細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察GFP 熒光信號。結(jié)果顯示，BaCSLD與GFP 形成的融合表達(dá)蛋白的熒光信號分布在煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜中(圖4)。

2.5 BaCSLD的表達(dá)分析

RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，BaCSLD在芥藍(lán)的三級花蕾及開放的花中表達(dá)，而在其他組織中未表達(dá)(圖5)。因而推測BaCSLD可能在花或者花粉發(fā)育過程的后期具有重要的功能。

3 討論

類纖維素合酶(CSL) 與大量的纖維素合酶(CesA)構(gòu)成了一個(gè)龐大的超基因家族，它們具有很高的序列相似性，且編碼的蛋白質(zhì)都具有糖基轉(zhuǎn)移酶的活性[13，18]。植物體中存在數(shù)量眾多的纖維素合酶基因，它們可能是漫長的進(jìn)化過程中染色體發(fā)生復(fù)制的結(jié)果。目前該家族內(nèi)各個(gè)基因的表達(dá)模式、功能鑒定和相互作用機(jī)制尚不明確[19-20]。

圖3 植物CSLD的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis based on CSLD protein

在植物中纖維素合酶基因主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，雖然CesA 蛋白在植物所有的組織和不同類型的細(xì)胞中都有表達(dá)，但家族中不同成員在植物發(fā)育的不同時(shí)期、不同的植物組織中的表達(dá)存在差異[20-21]。在擬南芥中，AtCesA1 在根、花、蓮座葉各個(gè)組織中都表達(dá)，而AtCesA9 僅在胚的發(fā)育過程中以及莖、葉片的連接處有表達(dá)[21]。CesA1、CesA9 基因在玉米中不同部位的表達(dá)水平也不同[22]。Suzuki 等[23]對毛果楊CSL的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CSL在毛白楊中也具有組織特異性表達(dá)。本研究中，BaCSLD僅在芥藍(lán)的大花蕾和開放的花中表達(dá)，可見不同的CSLD基因具有不同的表達(dá)模

圖4 BaCSLD 蛋白在煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of BaCSLD in leaf epidermal cells of tobacco

式[23-25]。類纖維素合酶家族中存在多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，這些保守域的蛋白質(zhì)序列賦予了該酶特定功能[26-27]。本研究結(jié)果顯示，BaCSLD 蛋白具有多個(gè)活性位點(diǎn)，多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的存在可能與BaCSLD的酶活性動(dòng)態(tài)變化相關(guān)[28]。目前，有關(guān)CSL基因家族功能的研究鮮見報(bào)道，大多數(shù)的類纖維素合成酶基因功能需要進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析[27-28]。本研究系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，BaCSLD 同源序列與擬南芥AtCSLD 親緣關(guān)系較近，這是由于芥藍(lán)和擬南芥同屬于十字花科，而BaCSLD 與油菜中的BnCSLD和蕪菁中的BrCSLD 關(guān)系較遠(yuǎn)，可能是由于在進(jìn)化過程中基因序列在一些重要位點(diǎn)發(fā)生了分化[29]，因而對該基因的表達(dá)模式及其功能分析進(jìn)行研究尤為重要。

近年來研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)植物花粉發(fā)育相關(guān)的CSL突變體[24，30]。如編碼OsCSLD4 蛋白的水稻SLE1(slender leaf1)基因，其突變體SLE1 在花粉形成、花藥開裂、氣孔形成等發(fā)育過程中表現(xiàn)出嚴(yán)重的發(fā)育缺陷[24]。類纖維素合酶D亞家族的成員CSLD1和CSLD4 在擬南芥成熟的花粉粒和花粉管中高表達(dá)，其突變體植株花粉管細(xì)胞壁的纖維素沉積顯著降低，而且花粉管細(xì)胞壁層序的組織性被明顯打破，進(jìn)一步對花粉管的萌發(fā)和生長以及雄配子體的傳遞效率產(chǎn)生了影響[30]。本研究從芥藍(lán)中分離到的BaCSLD在大花蕾及開放的花中特異表達(dá)，推測BaCSLD 可能與芥藍(lán)的生殖發(fā)育密切相關(guān)，下一步將通過在芥藍(lán)中進(jìn)行過表達(dá)分析結(jié)合擬南芥缺失突變體的互補(bǔ)驗(yàn)證對其功能進(jìn)行深入剖析，為全面了解類纖維素合成酶在植物生殖發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式提供參考。

圖5 BaCSLD 基因在芥藍(lán)不同組織中的表達(dá)Fig.5 Analysis of the expression pattern of the BaCSLD in different tissues of Brassica alboglabra

4 結(jié)論

本研究在芥藍(lán)中分離到類纖維素合成酶基因BaCSLD，分析表明BaCSLD屬于跨膜蛋白；亞細(xì)胞定位顯示，芥藍(lán)BaCSLD 蛋白分布于細(xì)胞膜。此外，通過RT-PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該BaCSLD僅在芥藍(lán)三級花蕾和開放的花組織中表達(dá)，說明該基因可能在花粉發(fā)育或植物生殖發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果為BaCSLD在植物生殖發(fā)育過程中的功能及調(diào)控作用研究奠定了基礎(chǔ)，但其在芥藍(lán)的生殖發(fā)育中起到何種調(diào)控作用還需進(jìn)一步深入研究。