白 冰 師長(zhǎng)宏

(空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

噴霧殺菌是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施內(nèi)進(jìn)行微生物控制的常用方法，所使用的消毒溶液主要為含氯消毒劑。該類消毒劑主要成分為次氯酸鹽。由于其工作濃度高、堿性強(qiáng)，具有易揮發(fā)、刺激性氣味大、性質(zhì)不穩(wěn)定、腐蝕性強(qiáng)等缺點(diǎn)。微酸性次氯酸液作為一種新型含氯消毒劑，其有效氯濃度低，消毒性能優(yōu)良、且腐蝕性小、極少有刺激性氣味[1]，近年來(lái)頗受關(guān)注。本研究所用微酸性次氯酸液殘留低，與有機(jī)物接觸可瞬間殺菌、瞬間失活，即使吸入也無(wú)毒性。消毒時(shí)由于使用的是超微粒子的噴霧，不會(huì)潤(rùn)濕皮膚和眼睛。為檢測(cè)該消毒液及其噴霧在屏障設(shè)施內(nèi)的殺菌效果，實(shí)驗(yàn)選取動(dòng)態(tài)飼養(yǎng)環(huán)境，進(jìn)行單次和連續(xù)消毒，以獲取屏障設(shè)施內(nèi)最優(yōu)微生物控制方案。

1 材料與方法

1.1 材料

NDX-1500PLB型微酸性次氯酸液生成器由OSG株式會(huì)社生產(chǎn)。生產(chǎn)能力70 L/h，功率為3 600 W，生產(chǎn)工藝見(jiàn)圖1。標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC6538)菌株，沙門菌(Saimonella，ATCC13311)菌株，均購(gòu)自ATCC。營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板由本實(shí)驗(yàn)室制備。細(xì)菌懸液制備，按《中華人民共和國(guó)藥典》2015版四部無(wú)菌檢查法和微生物限度檢查法和劉毅萍法[2-3]。

圖1 次氯酸水生產(chǎn)工藝Fig.1 Production process of hypochlorite solution

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1制備細(xì)菌懸液，濃度達(dá)到1×107cfu/mL，然后將無(wú)菌濾紙制成1 cm×1 cm 方形紙片，將制片浸入菌液中放置10 min，后取出制片晾干制成菌片備用。吸取消毒劑5.0 mL于無(wú)菌小平皿內(nèi)，將其置(20±1)℃水浴中5 min后，用無(wú)菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中。待作用至試驗(yàn)預(yù)定的時(shí)間，立即用無(wú)菌鑷子取出菌片移入含5.0 mL稀釋液試管中，作用10 min。用電動(dòng)混合器混合20 s，或?qū)⒃嚬苷翊?，吸取該最終樣液1.0 mL，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，(36±1)℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h后菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算殺菌率[4]，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2微酸性次氯酸液有效氯含量和pH值等理化指標(biāo)檢測(cè)參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.3檢測(cè)微酸性次氯酸液對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門菌殺滅作用。

1.2.3.1 模式Ⅰ：用微酸性次氯酸液噴霧設(shè)備對(duì)選取的屏障設(shè)施進(jìn)行噴霧殺菌，單次工作15 min，30 min后不同時(shí)間點(diǎn)使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板檢測(cè)落下菌數(shù)，并計(jì)算殺菌率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.2 模式Ⅱ：用微酸性次氯酸液噴霧設(shè)備對(duì)選取的屏障設(shè)施進(jìn)行連續(xù)噴霧殺菌，每日工作6次，每次工作5 min，休息5 min，每日連續(xù)工作1 h，30 min后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)落下菌數(shù)，連續(xù)工作21 d，每隔7 d檢測(cè)落下菌數(shù)并計(jì)算殺菌率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.3 模式Ⅲ:用酸化水對(duì)選取的屏障設(shè)施進(jìn)行連續(xù)噴霧殺菌，每日工作2次(上、下午各一次)，每次連續(xù)工作30 min、連續(xù)工作21 d，每隔7 d檢測(cè)落下菌并計(jì)算殺菌率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4實(shí)驗(yàn)選取的屏障設(shè)施為：5.6 m×6.0 m×2.5 m=84.0 m3；溫度為23.1 ℃，相對(duì)濕度為56.3%；小鼠飼養(yǎng)數(shù)量為500只，開(kāi)放飼養(yǎng)。

1.3 殺菌率計(jì)算

在微生物殺滅實(shí)驗(yàn)中，殺菌率(killing rate，KR)用百分率表示微生物被殺滅的數(shù)量，用于評(píng)價(jià)殺菌效果。實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)B1(cfu)，對(duì)照組菌落數(shù)B2(cfu)，按照下列公式計(jì)算KR：

2 結(jié)果

2.1 酸化水理化檢驗(yàn)結(jié)果

有效氯含量為6.84×10-2g/L，pH值為6.24。

2.2 微酸性次氯酸液的殺菌率

微酸性次氯酸液對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門菌作用15 min后的殺菌率可達(dá)到90%以上，見(jiàn)表1和圖2。

表1 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株的消殺結(jié)果Table 1 Sterilization result for standard bactericidal strain

圖2 微酸性次氯酸液對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門菌平板菌落的影響Fig.2 Effect of microacid hypochloric acid on bacterial result of Staphylococcus aureus and Salmonella

2.3 模式Ⅰ檢測(cè)結(jié)果

用微酸性次氯酸液噴霧設(shè)備單次工作15 min 后在2 h內(nèi)殺菌率維持在90%，48～72 h殺菌率低于30%(表2和圖3)。

表2 模式Ⅰ空氣落下菌殺菌結(jié)果(噴霧15 min)Table 2 Sterilization results of mode Ⅰ air fall bacteria (sprayed for 15 min)

2.4 模式Ⅱ檢測(cè)結(jié)果

21 d后殺菌率達(dá)到60%以上(表3和圖4)。

表3 模式Ⅱ空氣落下菌殺菌結(jié)果Table 3 Sterilization results of mode Ⅱ air fall bacteria

圖4 模式Ⅱ不同時(shí)間點(diǎn)落下菌數(shù)Fig.4 The number of mode Ⅱ air fall bacteria at different time

2.5 模式Ⅲ檢測(cè)結(jié)果

殺菌率可達(dá)到90%以上，見(jiàn)表4和圖5。

表4 模式Ⅲ空氣落下菌殺菌結(jié)果Table 4 Sterilization results of mode Ⅲ air fall bacteria

圖5 模式Ⅲ不同時(shí)間點(diǎn)落下菌數(shù)Fig.5 The number of mode Ⅲ air fall bacteria at different time

3 討論

含氯消毒劑廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施的日常消毒，通常是霧化后通過(guò)沾濕墻面的附著菌進(jìn)行殺菌，屬于遲效性殺菌，并且會(huì)呈大顆粒狀浮游于室內(nèi)。而當(dāng)人進(jìn)入房間后，會(huì)吸入大量的消毒劑或是附著于皮膚上或進(jìn)入眼睛引起不適，對(duì)動(dòng)物也會(huì)產(chǎn)生同樣的危害，其毒性和殘留性是在使用過(guò)程中存在的主要問(wèn)題。因此，在確保屏障設(shè)施消毒效果的基礎(chǔ)上，尋求高效、安全、可靠的消毒劑具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)選用的微酸性次氯酸消毒液殘留性低、有瞬間殺菌力，與有機(jī)物接觸會(huì)瞬間殺菌、瞬間失活，低濃度條件下即使吸入也無(wú)毒性。同時(shí)，為減少次氯酸殘留并進(jìn)一步提高消毒液的安全性[5]，將其分子結(jié)構(gòu)中的次氯酸離子變?yōu)榇温人岱肿印５疽簢婌F后呈霧狀漂流在室內(nèi)，若霧中的次氯酸分子不與空中浮游菌接觸則部分會(huì)氣化蒸發(fā)，失去作用。為減少氣化并提高次氯酸分子的比例，需要將液體pH值控制在7.0 以下。當(dāng)液體pH值在5～6.5時(shí)溶液中次氯酸分子的比例高達(dá)90%以上，此時(shí)溶液的殺菌效果最好[6]。本實(shí)驗(yàn)使用的消毒液pH值為6.24，這也是其具有較強(qiáng)殺菌效果的主要原因。

實(shí)驗(yàn)中選取兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株模擬墻壁和器物表面附著的細(xì)菌，進(jìn)行直接殺菌效果檢測(cè)。結(jié)果顯示，消毒液在15 min內(nèi)能有效殺滅細(xì)菌，殺菌率可達(dá)到90%以上，表明消毒液在短時(shí)間內(nèi)對(duì)物體表面細(xì)菌具有良好的殺菌能力，可作為屏障設(shè)施的特效殺菌劑。為進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)屏障設(shè)施內(nèi)空氣落下菌的殺菌效果，分別進(jìn)行單次和連續(xù)殺菌效果檢測(cè)，以獲取單次殺菌后的最長(zhǎng)維持時(shí)間和最佳殺菌時(shí)間。結(jié)果表明，單次噴霧工作后2 h內(nèi)，殺菌率可維持在90%以上，超過(guò)48 h菌落數(shù)與對(duì)照無(wú)差異。而每日單次工作1 h，連續(xù)工作21 d，殺菌率也只能達(dá)到60%以上。為了提高殺菌率，實(shí)驗(yàn)將殺菌次數(shù)改為每日兩次，每次持續(xù)工作30 min， 21 d后殺菌率可達(dá)到90%以上。以上結(jié)果充分說(shuō)明，消毒液能有效殺滅屏障設(shè)施內(nèi)的細(xì)菌，但需要進(jìn)行長(zhǎng)期連續(xù)的殺滅，并且要盡可能做到高頻次，這樣才能減少設(shè)施內(nèi)動(dòng)物感染的機(jī)率。如果在殺菌過(guò)程中出現(xiàn)間隔，最好控制在48 h之內(nèi)，超出該時(shí)間點(diǎn)后細(xì)菌數(shù)量會(huì)有明顯恢復(fù)。雖然該消毒液對(duì)人及動(dòng)物無(wú)害，但有研究表明其對(duì)碳鋼、銅為中度腐蝕，對(duì)鋁為輕度腐蝕，由于對(duì)金屬有輕度或中度腐蝕作用[7]，因此在屏障設(shè)施內(nèi)使用時(shí)應(yīng)盡量避免對(duì)上述金屬直接作用。另有研究表明，其對(duì)芽孢的殺滅取決于所在載體不同而有所差異[7]，因此，制定殺滅策略時(shí)要根據(jù)不同環(huán)境進(jìn)行有針對(duì)性的調(diào)整，才能收到預(yù)期效果。實(shí)驗(yàn)中所使用的噴霧設(shè)備也得到了充分的檢測(cè)，證明其完全符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施殺菌要求。雖然消毒液不能100%殺滅環(huán)境中的細(xì)菌，但其可靠性和高效率是明確的，尤其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施內(nèi)微生物控制具有良好的作用，也為其他實(shí)驗(yàn)室的消毒提供了參考方案。