趙 麗 刁瑞英 蔡昭煒 李青洋 陳 博 李雪玲 王志鳴

(1. 東莞市松山湖中心醫(yī)院生殖中心，東莞 523326)(2. 深圳市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，深圳 518000)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指女性40歲前發(fā)生的卵巢功能衰竭，臨床表現(xiàn)為絕經(jīng)且伴有雌激素水平下降和促性腺激素水平上升的疾病[1]。miRNA是一類長度約為19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)其在卵巢的生長發(fā)育衰老等過程中起到了重要的作用[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-320在多囊卵巢綜合征患者卵泡上清液中的表達(dá)顯著下降[3]，然而，目前關(guān)于miRNA-320對POF的影響鮮見報道。順鉑是臨床癌癥治療應(yīng)用最廣泛的鉑類藥物，但其不良反應(yīng)與卵巢的損害密切相關(guān)，其可誘導(dǎo)大鼠卵泡損傷、引起卵巢組織壞死并促進(jìn)卵巢早衰[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用順鉑誘導(dǎo)建立大鼠卵巢早衰模型，并轉(zhuǎn)染miRNA-320模擬物，探討miRNA-320對順鉑誘導(dǎo)卵巢早衰大鼠卵巢功能的影響，為臨床治療卵巢早衰提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物建模及分組

選擇清潔級SD雌性大鼠32只，體質(zhì)量200～220 g，購自中國科學(xué)院昆明動物研究所，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滇)K2016-0001。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。正常對照組：常規(guī)飼養(yǎng)，腹腔注射生理鹽水，連續(xù)7 d；模型組[5]：6 mg/kg腹腔注射順鉑注射液，連續(xù)7 d；陰性對照組：在建立模型后轉(zhuǎn)染NC agomir；miRNA-320 過表達(dá)組：在建立模型后轉(zhuǎn)染miRNA-320 agomir；造模結(jié)束7 d后麻醉處死大鼠，取大鼠卵巢組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

BCA蛋白定量試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Trizol、miRNA-320、U6，購自美國Invitrogen公司；PGRMC1、BMP15、GAPDHqRT-PCR上下游引物，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自德國DBI公司；PGRMC1兔多克隆抗體、BMP15兔多克隆抗體、山羊抗兔二抗，購自美國LI-COR公司；雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)ELISA試劑盒，購自上海索萊寶生物科技有限公司。

2 觀察指標(biāo)

2.1 大鼠行為學(xué)變化

在實(shí)驗(yàn)過程中，每天觀察各組大鼠飲食、活動和體毛等外在表現(xiàn)。

2.2 采用ELISA檢測各組大鼠血清中E2、FSH、LH的含量

各組大鼠造模結(jié)束7 d后，腹主動脈取血，3 500 r/min離心10 min取血清，采用ELISA檢測各組大鼠血清中E2、FSH、LH的含量。

2.3 采用HE染色，光鏡下觀察各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化

造模結(jié)束后，麻醉處死各組大鼠，取出卵巢置于4%多聚甲醛液中固定。制作石蠟常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察大鼠卵巢組織形態(tài)變化。

2.4 采用qRT-PCR檢測各組大鼠卵巢組織miRNA-320的表達(dá)水平

取卵巢組織加入1 mL Trizol提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物序列Ⅰ見表1。

表1 引物序列ⅠTable 1 The sequence of primers Ⅰ

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。各組基因的相對表達(dá)量按公式(2-△△Ct法)計(jì)算，每個樣本重復(fù)檢測3次。

2.5 采用Western blot和qRT-PCR法檢測各組大鼠卵巢組織中PGRMC1、BMP15的表達(dá)水平

提取總蛋白后采用BCA法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，添加PGRMC1及BMP15兔多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜；添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)，室溫下孵育1 h。洗膜后，用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測條帶，Image J軟件測定條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算PGRMC1及BMP15的蛋白相對表達(dá)量。qRT-PCR法參照方法2.4。引物序列Ⅱ見表2。

表2 引物序列ⅡTable 2 The sequence of primers Ⅱ

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 各組大鼠行為學(xué)變化

正常對照組大鼠活動、進(jìn)食排便均正常，體毛光滑有光澤；模型組及陰性對照組大鼠活動遲緩、無精神、反應(yīng)遲鈍、食欲下降、體質(zhì)量下降以及體毛暗淡無光澤；miRNA-320過表達(dá)組大鼠活動量增加、反應(yīng)較為敏捷、進(jìn)食增多且體毛逐漸有光澤。過表達(dá)miRNA-320可改善模型組大鼠的行為學(xué)能力。

4.2 各組大鼠血清中E2、FSH、LH的含量

與正常對照組相比，模型組及陰性對照組大鼠血清E2的含量降低而FSH、LH的含量升高；與陰性對照組相比，miRNA-320過表達(dá)組血清E2的含量升高而FSH、LH的含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中E2、FSH、LH的含量Table 3 The serum levels of E2，F(xiàn)SH and LH in different groups

4.3 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化

正常對照組卵巢組織內(nèi)可見豐富的卵泡及黃體，間質(zhì)纖維組織少，顆粒細(xì)胞層次多；模型組及陰性對照組觀察卵巢組織明顯萎縮，閉鎖卵泡數(shù)目多，間質(zhì)纖維組織增多，黃體數(shù)少；miRNA-320 過表達(dá)組間質(zhì)纖維化明顯減輕，成熟卵泡數(shù)量明顯增加，黃體數(shù)增多。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色)Fig.1 The histological changes of ovaries in different groups(HE staining)

4.4 各組大鼠miRNA-320的表達(dá)水平

與正常對照組相比，模型組及陰性對照組大鼠miRNA-320的表達(dá)水平降低，而miRNA-320過表達(dá)組miRNA-320的表達(dá)水平與陰性對照組相比升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠miRNA-320相對表達(dá)量注：與正常對照組相比，*P<0.05；與陰性對照組相比，#P<0.05Fig.2 The relative expression of miRNA-320 in different groupsNote:Compared with the normal control group,*P<0.05；Compared with the negative group,#P<0.05

4.5 各組大鼠卵巢組織中PGRMC1、BMP15蛋白及mRNA表達(dá)水平

與正常對照組相比，模型組及陰性對照組大鼠PGRMC1、BMP15的蛋白和mRNA表達(dá)水平均降低，而miRNA-320過表達(dá)組PGRMC1、BMP15的蛋白和mRNA的表達(dá)水平與陰性對照組相比均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠卵巢組織中PGRMC1、BMP15蛋白及mRNA表達(dá)水平注：與正常對照組相比，*P<0.05；與陰性對照組相比，#P<0.05Fig.3 The expression levels of PGRMC1，BMP15 and mRNA in ovaries of different groupsNote:Compared with the normal control group,*P<0.05；Compared with the negative control group,#P<0.05

5 討論

POF可由多種因素引起，如感染、代謝疾病、自身免疫性疾病、放射、化療或卵巢的物理損傷?；熁蚍暖熤委煱┌Y患者的副作用之一是增加卵巢損傷，從而導(dǎo)致不孕[6]。順鉑是一種常用的化療藥物，有研究表明其在殺死腫瘤細(xì)胞的同時也可對正常細(xì)胞造成不同程度的傷害，而順鉑在化療過程中引發(fā)卵巢功能低下的報道逐年增加[7-9]。研究表明，可通過測定激素如FSH、E2、抑制素B等水平來評估化療引起的卵巢損傷[10]。因此，本研究建立了順鉑處理大鼠卵巢損傷的POF模型。7 d后，模型組大鼠活動遲緩、無精神、反應(yīng)遲鈍、食欲下降、體質(zhì)量下降以及體毛暗淡無光澤，而正常對照組大鼠活動、進(jìn)食排便均正常且體毛光滑有光澤。組織形態(tài)學(xué)分析表明，卵巢組織明顯萎縮，皮質(zhì)變薄，閉鎖卵泡數(shù)目多，間質(zhì)纖維組織增多。此外，與正常對照組相比，血清FSH、LH顯著升高，而血清E2顯著降低，上述結(jié)果提示卵巢功能明顯受損，并成功通過順鉑建立POF模型。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)具有卵母細(xì)胞特異性表達(dá)模式，在早期卵泡形成中起著重要作用[11]。有研究表明，BMP15可介導(dǎo)原始卵泡的激活、影響E2和孕酮的分泌，BMP15缺失會導(dǎo)致卵巢衰竭[12]。孕酮受體膜成分1(PGRMC1)屬于膜相關(guān)孕酮受體家族，其可促進(jìn)乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等發(fā)生發(fā)展[13-15]。PGRMC1基因在嚙齒動物和靈長類卵巢的顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞中高度表達(dá)，其在抗凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程中的作用提示其可調(diào)節(jié)卵泡生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組大鼠卵巢組織中PGRMC1、BMP15的蛋白和mRNA表達(dá)水平均降低，提示順鉑通過抑制PGRMC1、BMP15的表達(dá)，導(dǎo)致卵巢功能紊亂，促進(jìn)卵巢早衰。

miRNA作為重要的基因表達(dá)調(diào)控分子，通過與靶基因mRNA堿基互補(bǔ)配對，調(diào)控靶基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖分化、凋亡、代謝等一系列生理過程中發(fā)揮作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-320在上皮性卵巢癌組織中呈低表達(dá)，上調(diào)SKOV3細(xì)胞中miRNA-320表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖及細(xì)胞侵襲力[17]。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-320可通過靶向抑制Runx2，調(diào)節(jié)Runx2/CYP11A1級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)多囊卵巢綜合癥患者的雌激素合成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，miRNA-320 過表達(dá)組大鼠活動量增加、反應(yīng)較為敏捷、進(jìn)食增多且體毛逐漸有光澤。過表達(dá)miRNA-320可改善模型組大鼠的行為學(xué)能力。此外，miRNA-320 過表達(dá)組大鼠血清E2的含量升高而FSH、LH的含量降低。組織形態(tài)學(xué)分析表明，miRNA-320 過表達(dá)組間質(zhì)纖維化明顯減輕，成熟卵泡數(shù)量明顯增加，黃體數(shù)增多。過表達(dá)miRNA-320后，卵巢組織中PGRMC1、BMP15的蛋白和mRNA的表達(dá)水平與陰性對照組相比均顯著升高；提示過表達(dá)miRNA-320可改善順鉑誘導(dǎo)的卵巢早衰，具有調(diào)節(jié)卵巢功能的作用。

綜上所述，順鉑可誘導(dǎo)卵巢早衰大鼠卵巢功能障礙；過表達(dá)miRNA-320可改善順鉑誘導(dǎo)的卵巢早衰大鼠的卵巢功能，為臨床治療POF提供理論依據(jù)。