王學(xué)文 劉佐民 王勁松 李永清

(1. 中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 102629)(2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097)

流行性感冒簡稱流感，是一種由甲型流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。甲型流感病毒可以引起人和多種動(dòng)物感染發(fā)病。由于流感病毒具有高突變率和高變異性，病毒的不斷變異[1-3]往往導(dǎo)致疾病的大暴發(fā)與大流行，給人類的健康乃至生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了重大損失。另外，抗流感病毒藥物的研發(fā)是流感防治的重要目標(biāo)，然而該病毒的這種高突變率與高變異性為抗病毒藥物的研發(fā)帶來很大困難，抗流感病毒藥物研發(fā)是流感防治研究的重要目標(biāo)之一。

中藥是我國醫(yī)藥的寶貴資源，從古到今在防治流感疾病方面發(fā)揮了重大的作用，不僅對(duì)流感病毒有直接殺傷作用，還能調(diào)動(dòng)機(jī)體特異性和非特異性免疫功能來增強(qiáng)抗病毒能力。由蒲公英、百部、白薇、白術(shù)等多味中藥組成的復(fù)方中藥是北京洪天力藥業(yè)有限公司提供的臨床經(jīng)驗(yàn)方，該復(fù)方中藥具有解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗感染、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫功能等作用[4-7]。前期對(duì)該復(fù)方中藥抗流感病毒作用進(jìn)行了研究，證實(shí)了該中藥具有體外多環(huán)節(jié)抗流感病毒作用[8]，體內(nèi)具有抑制流感病毒在肺內(nèi)增殖，減輕流感病毒造成的肺損傷的功效[9]。但有關(guān)該藥對(duì)流感病毒感染后免疫功能的影響尚不明確，因此，本實(shí)驗(yàn)以流感病毒A/PR/8/34(H1N1)滴鼻。感染小鼠造模，進(jìn)一步觀察免疫器官指數(shù)，T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和肺組織中的細(xì)胞因子水平，以期進(jìn)一步明確復(fù)方中藥抗流感病毒作用，探索作用機(jī)理，為該復(fù)方中藥的臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌性90只，6～8周齡，18～22 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0010。飼養(yǎng)于北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所隔離器中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SYXK(京)2017-0039。環(huán)境參數(shù)：溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度(55±15)%，壓差≥50 Pa，潔凈度5級(jí)，明暗交替12 h/12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后開始進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)福利倫理審查號(hào)：20150316-3。實(shí)驗(yàn)期間，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2病毒:H1N1鼠肺適應(yīng)株全稱流感病毒A/PR/8/34(H1N1)，簡稱流感病毒PR8，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉金華老師饋贈(zèng)。經(jīng)雞胚傳代增殖2輪，過濾后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩＝?jīng)測定LD50為10-3.375/50 μL。

1.2 試劑及儀器

復(fù)方中藥(北京洪天力藥業(yè)有限公司提供的臨床經(jīng)驗(yàn)方)；鹽酸金剛烷胺、刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)、淋巴細(xì)胞分離液Histopaque 1083、RPMI 1640 培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma公司)；小鼠IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒(Ebioscience公司)。

CO2培養(yǎng)箱HF151(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀Model 550(Bio-Rad公司)；生物安全柜BHC-1300IIA2(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；-80 ℃冰箱DW-HL828(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)；超純水系統(tǒng)Milli-Q Integral(Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及流感病毒模型的建立：將90只雌性BALB/c小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。稱量記錄后隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，鹽酸金剛烷胺對(duì)照組，復(fù)方中藥高、中、低劑量組，每組15只，5只/籠。分組及給藥劑量見表1。按人和小鼠劑量關(guān)系[10]轉(zhuǎn)換成復(fù)方中藥中劑量組劑量為0.75 g/kg，并以中劑量的2倍作為復(fù)方中藥高劑量組劑量，中劑量的1/2作為復(fù)方中藥低劑量組劑量。試驗(yàn)前用100 ℃去離子水進(jìn)行稀釋配制，復(fù)方中藥制劑高、中、低劑量濃度分別為75 mg/mL，37.5 mg/mL和18.8 mg/mL。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組Table 1 The group of experimental animals

復(fù)方中藥組灌胃2 d后，空白對(duì)照組小鼠滴鼻生理鹽水50 μL/只，其他各組攻毒流感病毒PR8 10LD50/50 μL。病毒感染4 h后，中藥各組灌胃給藥，連續(xù)灌胃5 d，1次/d，0.2 mL/10 g?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予去離子水，鹽酸金剛烷胺組灌胃10 mg/mL鹽酸金剛烷胺，灌胃體積、時(shí)間和方式同中藥三個(gè)劑量組。

1.3.2復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染BALB/c小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的測定流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后，小鼠禁食不禁水12 h后，稱體質(zhì)量，無菌取血。然后頸椎脫臼處死，摘取胸腺和脾臟并稱質(zhì)量，按下列公式計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)：

脾臟指數(shù)=(小鼠脾質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量)×100%

胸腺指數(shù)=(小鼠胸腺質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量)×100%

1.3.3復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染BALB/c小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的測定：流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后的小鼠無菌取外周血于肝素鈉潤濕的2 mL離心管中，加入PBS混勻后，將混勻后的血樣輕輕加到淋巴細(xì)胞分離液的液面上。2 000 r/min離心20 min，小心吸取分離液和PBS之間的白色霧狀細(xì)胞至新的試管中，即為外周血單核細(xì)胞。沉淀再用1 mL 1640完全營養(yǎng)液重懸，制得淋巴細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色，顯微鏡計(jì)數(shù)其中的活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整至2×106個(gè)/mL。細(xì)胞懸液內(nèi)一份加入ConA，每孔100 μL，每組4個(gè)重復(fù)，ConA最終濃度為5 μg/mL，用于測定T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；另一份加入LPS，每孔100 μL，每組4個(gè)重復(fù)，調(diào)整LPS最終濃度為10 μg/mL，用于測定B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。細(xì)胞板置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱2 d后，加入5 mg/mL 20 μL，MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，置于超凈工作臺(tái)上，加150 μL，DMSO震蕩溶解10 min，用酶標(biāo)儀A570讀數(shù)。以各樣本A值表示T、B淋巴細(xì)胞的增殖能力[11]。

1.3.4復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺組織中細(xì)胞因子水平的測定：流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后，小鼠禁食不禁水12 h后處死，打開胸腔并摘取全肺，用生理鹽水沖洗干凈，再用濾紙吸干水分，電子天平稱質(zhì)量。分別取肺臟置勻漿器中加冷生理鹽水，肺臟質(zhì)量與生理鹽水體積比為1∶9，在冰浴中研磨制成勻漿，4 ℃離心后取上清準(zhǔn)備檢測細(xì)胞因子。IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子測定方法均是采用雙抗夾心法測定，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染BALB/c小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

流感病毒PR8感染BALB/c小鼠后，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低 (P<0.01)。采用復(fù)方中藥和鹽酸金剛烷胺治療后，與模型對(duì)照組相比，復(fù)方中藥中劑量組胸腺指數(shù)顯著升高 (P<0.01)，復(fù)方中藥中劑量組脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)；其他組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)也都有所增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)方中藥高、中、低劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方中藥對(duì)PR8感染BALB/c小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Table 2 Influence of compound traditional Chinese medicine on the spleen index and thymus index of PR8 infected BALB/c mice

2.2 復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染BALB/c小鼠的T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響

流感病毒PR8感染小鼠后，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組T、B淋巴細(xì)胞A值顯著降低(P<0.01)；經(jīng)藥物治療后，與模型對(duì)照組相比，復(fù)方中藥中劑量組T、B淋巴細(xì)胞A值顯著增高(P<0.05)，其他組T、B淋巴細(xì)胞A值均有不同程度的增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)方中藥高、中、低劑量組之間的T、B淋巴細(xì)胞A值兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 復(fù)方中藥對(duì)PR8感染小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 3 Influence of compound traditional Chinese medicine on multiplication of T and B lymphocytes in PR8 infected mice

2.3 復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺組織中細(xì)胞因子水平的影響結(jié)果

2.3.1復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺組織中TNF-α和IL-6含量的影響

流感病毒感染小鼠5 d后，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組TNF-α和IL-6顯著升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組相比，復(fù)方中藥中劑量組和復(fù)方中藥低劑量組TNF-α顯著降低 (P<0.01)，復(fù)方中藥中劑量組IL-6顯著降低 (P<0.05)，其他組均有不同程度的降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)方中藥高、中、低劑量組的TNF-α和IL-6含量兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表4。

表4 復(fù)方中藥對(duì)PR8感染BALB/c小鼠肺組織中TNF-α和IL-6含量的影響Table 4 Impact of compound traditional Chinese medicine on lung tissue TNF-α和IL-6 concent in PR8 infected BALB/c mice

2.3.2復(fù)方中藥對(duì)流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺組織中IL-10含量的影響：模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，IL-10顯著降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組相比，灌胃給藥后，復(fù)方中藥中劑量組IL-10顯著升高 (P<0.05)，其他組均有不同程度的升高，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)方中藥高、中、低劑量組的IL-10含量兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表5。

表5 復(fù)方中藥對(duì)PR8感染BALB/c小鼠肺組織中IL-10含量的影響Table 5 Impact of compound traditional Chinese medicine on lung tissue IL-10 concent in PR8 infected BALB/c mice

2.3.3復(fù)方中藥對(duì)PR8感染BALB/c小鼠肺組織中IFN-γ含量的影響：與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組IFN-γ顯著降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組相比，復(fù)方中藥中、低劑量組IFN-γ顯著升高(P<0.01)，復(fù)方中藥高劑量組IFN-γ顯著升高(P<0.05)；復(fù)方中藥高、中、低劑量組的IFN-γ含量兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表6。

表6 復(fù)方中藥對(duì)PR8感染BALB/c小鼠肺組織中IFN-γ含量的影響Table 6 Impact of compound traditional Chinese medicine on lung tissue IFN-γ concent in PR8 infected BALB/c mice

3 討論

脾臟是機(jī)體識(shí)別異物，促進(jìn)免疫細(xì)胞分化增殖，進(jìn)而發(fā)生免疫應(yīng)答的場所；脾臟指數(shù)能夠反映機(jī)體免疫細(xì)胞分化增殖能力。胸腺是T淋巴細(xì)胞的發(fā)生成熟的場所，流感病毒能通過樹突狀細(xì)胞從肺轉(zhuǎn)移到胸腺并干擾 T 淋巴細(xì)胞的合成[12]，胸腺指數(shù)能初步反映機(jī)體的免疫狀況。 實(shí)驗(yàn)中流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低，進(jìn)一步證明小鼠流感病毒感染模型建立成功。各組小鼠連續(xù)灌胃藥物7 d后，與模型對(duì)照組相比，復(fù)方中藥中劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高，原因有可能是復(fù)方中藥中劑量組的小鼠病毒感染后引起免疫應(yīng)答，引起胸腺和脾臟內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，抑制其免疫器官的萎縮。其他藥物組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有不同程度的升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是其引起的免疫應(yīng)答不足以抑制PR8感染小鼠的免疫器官胸腺和脾臟發(fā)生內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。

淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是檢測機(jī)體免疫功能的常用指標(biāo)，淋巴細(xì)胞增殖能力高低反應(yīng)細(xì)胞免疫和體液免疫水平的變化。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞都是特異性免疫的主要細(xì)胞，ConA體外可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖，LPS能誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的增殖。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠的T、B淋巴細(xì)胞A值均顯著降低，表明流感病毒可以明顯抑制小鼠淋巴細(xì)胞增殖，抑制了機(jī)體免疫功能；小鼠攻毒后繼續(xù)灌胃藥物5 d后，與模型對(duì)照組相比，復(fù)方中藥中劑量組小鼠T、B淋巴細(xì)胞顯著升高，表明復(fù)方中藥中劑量組可改善小鼠細(xì)胞功能，提高機(jī)體的免疫能力。而其他藥物組T、B淋巴細(xì)胞A值均有不同程度的升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明可能其不足以改善小鼠細(xì)胞功能，提高機(jī)體的免疫能力。

機(jī)體感染流感病毒可引起肺部間質(zhì)性肺炎，對(duì)肺部造成一定損傷，生成一些超出生理濃度的細(xì)胞因子，過多的細(xì)胞因子導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化，白細(xì)胞遷移和毛細(xì)血管的滲漏等，增加對(duì)腎臟毒性，嚴(yán)重的可以引起心腎衰竭，引起死亡[13-14]。細(xì)胞因子按功能可以分為促炎因子與抗炎因子兩類。復(fù)方中藥治療病毒感染性疾病并不是單純抗病毒，還可以抑制或調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥免疫病理反應(yīng)[15-16]。因?yàn)榉闻K是流感病毒的靶器官，本實(shí)驗(yàn)測定小鼠連續(xù)灌胃藥物5 d后肺組織勻漿中的細(xì)胞因子，可更直接反應(yīng)藥物調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌改變機(jī)體的炎癥損傷的狀態(tài)。

TNF-α是重要的炎癥促進(jìn)因子，被認(rèn)為是前炎癥因子的關(guān)鍵因子，可以控制后來的前炎癥細(xì)胞因子如IL-6的產(chǎn)生。當(dāng)TNF-α的濃度升高時(shí)，可以介導(dǎo)炎性反應(yīng)的許多病變過程，比如引起局部炎性反應(yīng)，造成器官甚至系統(tǒng)的損害。IL-6是一種小分子糖蛋白，也是一種重要的促炎性因子。二者均為致炎因子，它們是構(gòu)成免疫性病理損害的重要因素[17]，阻斷二者的過量產(chǎn)生，可以減輕或清除其對(duì)器官的損傷。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，流感病毒PR8感染BALB/c小鼠5 d后，肺組織中TNF-α和IL-6均明顯高于空白對(duì)照組，說明病毒感染可引起機(jī)體免疫功能紊亂，通過引起TNF-α及IL-6的大量釋放，造成肺部炎癥損傷。經(jīng)復(fù)方中藥干預(yù)治療后，與模型對(duì)照組相比，復(fù)方中藥中劑量組小鼠肺組織中IL-6和TNF-α顯著降低；復(fù)方中藥低劑量組小鼠肺組織中TNF-α顯著降低。表明復(fù)方中藥能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，使機(jī)體對(duì)病毒產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，并將其進(jìn)行清除，從而減輕小鼠感染流感病毒過程中降低炎性因子的表達(dá)，減少了局部或全身的炎癥損傷。

伴隨著炎性細(xì)胞因子的趨化、活化和釋放，機(jī)體同時(shí)會(huì)分泌炎癥抑制因子對(duì)其進(jìn)行反向調(diào)節(jié)。IL-10近些年來受到大量關(guān)注，針對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)起著非常重要的作用[18]。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠感染流感病毒后IL-10明顯降低，表明流感病毒可以導(dǎo)致機(jī)體抗炎性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)降低?？赡苡捎诩?xì)菌或病毒吸附在呼吸道黏膜表面或上皮細(xì)胞上，直接造成損害，影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，致使其分泌水平的下降，這與胡旭[19]報(bào)道一致。經(jīng)復(fù)方中藥干預(yù)治療后，各組小鼠肺組織IL-10基因的表達(dá)相對(duì)模型對(duì)照組均有不同程度的增加，且復(fù)方中藥中劑量組IL-10顯著升高，表明了復(fù)方中藥能明顯上調(diào)流感病毒感染小鼠過程中肺組織中抗炎因子IL-10的表達(dá)。

IFN-γ是一種廣泛的抗病毒物質(zhì)，有著廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用的抗病毒物質(zhì)，幾乎對(duì)所有病毒都有一定程度的抑制作用，被認(rèn)為是抑制宿主病毒感染的第一道防線[20]。本研究結(jié)果顯示流感病毒PR8感染小鼠后，肺組織中IFN-γ的含量明顯降低，說明流感病毒PR8感染BALB/c小鼠后，可抑制其免疫調(diào)節(jié)功能，降低抗病毒能力。經(jīng)復(fù)方中藥干預(yù)治療后，復(fù)方中藥中、低劑量組IFN-γ含量均明顯升高，都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明復(fù)方中藥具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒，清除病原體等作用。

此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方中藥中劑量調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌能力優(yōu)于復(fù)方中藥高劑量組和復(fù)方中藥低劑量組，這有可能是復(fù)方中藥高劑量組本身對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的副作用，復(fù)方中藥低劑量組藥物有效濃度不夠，不能顯著調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分子。與模型對(duì)照組相比，鹽酸金剛烷胺在降低促炎性因子TNF-α和IL-6，提高抗炎性因子IL-10和提高抗病毒因子IFN-γ方面，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明鹽酸金剛烷胺并不是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌的途徑來抑制流感病毒的增殖。

復(fù)方中藥可以減輕免疫器官脾臟和胸腺萎縮程度，通過改善流感感染小鼠的T細(xì)胞免疫和B淋巴細(xì)胞體液免疫功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子濃度來發(fā)揮其抗病毒作用。然而復(fù)方中藥抗流感病毒作用是否還存在其他作用機(jī)制還有待進(jìn)一步證實(shí)。