楊 帆 楊 艷 王曉亮 孫 薇 陳 軍

(空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院疼痛生物醫(yī)學研究所，西安 710038)

腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)是一類無包被，直徑約為22 nm 的單鏈DNA 病毒。它是一種非致病病毒。由于，其自身的安全性和低免疫原性且可持續(xù)表達的特性已成為神經(jīng)系統(tǒng)研究和基因治療的重要工具之一[1-4]。目前，已發(fā)現(xiàn)100多種腺相關病毒，由于組成衣殼蛋白在空間構象及序列上的差異，導致其對不同的細胞或組織具有不同的轉導效能[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)[6]，AAV8 基因型最顯著的特點是轉導肝臟組織，同時也可轉導大腦神經(jīng)元及背根神經(jīng)節(jié)(DRG)。AAV4對肺的選擇特異性高[7]。AAV1和AAV7在骨骼肌細胞轉導快速且表達量很高，AAV1、AAV4和AAV5對中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向性明顯；AAV2對腎臟具有高的選擇性；AAV8對心臟和胰腺轉導效能優(yōu)異[8]。在腺相關病毒載體對外周神經(jīng)系統(tǒng)的研究中，Storek等[9]通過鞘內給藥方式給予雄性SD大鼠攜帶抗傷害性疼痛基因的腺相關病毒(AAV1和AAV8)載體，發(fā)現(xiàn)AAV8在轉染DRG神經(jīng)元的效果最佳。Mason等[10]在雌性Wistar大鼠采用DRG直接注射的方式，比較了不同血清型腺相關病毒(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6和AAV8)載體對初級感覺神經(jīng)元的轉染效果，發(fā)現(xiàn)AAV5的轉染效果最佳。由此可見，由于不同實驗動物品系以及給藥方式的差異，腺相關病毒載體對DRG神經(jīng)元的轉導效能也存在著不同。因此，為了更加精確地了解腺相關病毒載體對雄性SD大鼠DRG神經(jīng)元的轉導效能，我們利用免疫熒光技術對4種不同血清型腺相關病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)載體對DRG神經(jīng)元的轉導效能與表達進行了比較，發(fā)現(xiàn)AAV9對雄性SD大鼠DRG神經(jīng)元的轉導效能最佳。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

腺相關病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)載體購自漢恒生物技術有限公司。24只雄性SD大鼠(180～200 g)，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(陜)2019-001。

1.2 實驗方法

1.2.1分組：SD大鼠隨機分為8組，每組3只，分別通過DRG直接注射的方式給予腺相關病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)載體。飼養(yǎng)期間保持動物自由飲食和飲水，晝夜交替間隔12 h。

1.2.2DRG注射腺相關病毒載體：將實驗動物用1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉后，沿大鼠背部中線位置切開，用咬骨剪，剪去脊柱部分椎板，暴露左側L3、L4、L5的 DRG，用微量注射器扎入DRG中心位置，等待3 min以便針尖部位組織恢復到封閉狀態(tài)，然后注入AAV溶液10 μL，注射完畢等待1～2 min后再拔出微量注射器，防止腺相關病毒載體滲出，依次注射暴露的DRG，之后逐層縫合大鼠傷口。

1.2.3組織切片的熒光分析：將注射3周和4周后的大鼠用1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔麻醉，預冷生理鹽水和4%多聚甲醛依次行主動脈灌注，灌流結束后取出左側L3、L4和L5的DRG，置于4%多聚甲醛中固定，隨后經(jīng)15%和30%蔗糖溶液梯度脫水直至組織完全沉糖，液氮速凍。用OCT包埋后冰凍切片機切片(12 μm)，并逐一貼片于掛膠載玻片上，將玻片置于避光環(huán)境自然風干后，0.01%的PBS漂洗3次，10 min/次，再次避光自然風干使用抗熒光淬滅劑封片。在Olympus-FV1000共聚焦顯微鏡下進行拍片，選用Image J 圖像分析系統(tǒng)計算熒光強度。每組3只大鼠，每只大鼠的L3、L4和L5 DRG分別取5～8張連續(xù)切片。

2 結果

2.1 4種不同血清型AAV病毒在大鼠DRG神經(jīng)元轉染結果比較

組織切片熒光結果顯示：注射后3周，AAV5對DRG神經(jīng)元幾乎無轉染，AAV6和AAV8對DRG神經(jīng)元均略有轉染， AAV9的轉染效果最好(圖1、表1)。注射后4周，AAV5、AAV6及AAV8對DRG神經(jīng)元的轉染效果相似，AAV9對DRG神經(jīng)元的轉染效果最佳，神經(jīng)元和纖維束均清晰可見(圖2、表1)。

圖1 DRG直接注射不同血清型的AAV病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)3周后神經(jīng)元綠色熒光蛋白的表達及定量注：A.DRG切片免疫熒光示例圖表明AAV9對神經(jīng)元的轉染效率最高；B.平均兔疫熒光強度定量表明AAV9對神經(jīng)元的轉染強度最高Fig.1 GFP expression and quantification in sections of DRG 3 weeks after injected with vectors based on AAV serotypes 5,6,8 and 9Note:A.Representative immunofluorescence sections show that AAV9 has the highest transduction rate.B.Quantification of the mean immunofluorescent intensity shows that AAV9 has the highest transduction intensity

表1 不同血清型AAV病毒在大鼠DRG神經(jīng)元轉染效果Table 1 The transfection effect of different AAV serotypes in rat DRG neurons

圖2 DRG直接注射不同血清型的AAV病毒以(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)4周后神經(jīng)元綠色熒光蛋白的表達及定量注：A.DRG切片免疫熒光示例圖表明AAV9對神經(jīng)元的轉染效率最高；B.平均兔疫熒光強度定量表明AAV9對神經(jīng)元的轉染強度最高Fig.2 GFP expression and quantification in sections of DRG 4 weeks after injected with vectors based on AAV serotypes 5,6,8 and 9Note:A.Representative immunofluorescence sections show that AAV9 has the highest transduction rate.B.Quantification of the mean immunofluorescent intensity shows that AAV9 has the highest transduction intensity

2.2 同種血清型AAV病毒不同時間在大鼠DRG神經(jīng)元轉染結果比較

為了對比AAV病毒轉染的時程與效果間的關系，本研究對同種血清型AAV病毒分別轉染3 周和4 周的平均熒光強度進行分析比較。如圖3所示：病毒注射第4周相較于注射第3周，AAV5的轉染效果(平均熒光強度)明顯增高，AAV6的轉染效果未見明顯變化，AAV8的轉染效果明顯增強，AAV9對DRG神經(jīng)元的轉染效率顯著提高。

圖3 DRG直接注射不同血清型的AAV病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)3周和4周后神經(jīng)元綠色熒光強度對比Fig.3 The comparison of the mean immunofluorescent intensity between 3 and 4 weeks in sections of DRG after inected with vectors based on AAV serotypes 5,6,8 and 9

綜上所述，對雄性SD大鼠DRG直接注射不同血清型腺相關病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)載體3 周和4 周后，AAV9對大鼠DRG神經(jīng)元的轉染效能最佳。

3 討論

腺相關病毒載體具有較高的安全性、低免疫原性、可持續(xù)表達等特性，已成為神經(jīng)系統(tǒng)研究以及基因治療的重要工具之一。但由于衣殼蛋白在空間構象及蛋白序列存在差異，因此不同血清型腺相關病毒載體在不同生物種系的組織和細胞的轉導效能上存在差異。Storek等[9]通過鞘內給藥方式，給予雄性SD大鼠攜帶抗傷害性疼痛基因的腺相關病毒(AAV1和AAV8)載體，發(fā)現(xiàn)AAV8對DRG神經(jīng)元的轉導效能最佳；而Mason[10]實驗室在雌性Wistar大鼠上用DRG直接注射的方式，比較了不同血清型的腺相關病毒(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6和AAV8)載體對DRG初級感覺神經(jīng)元的轉導效能，發(fā)現(xiàn)AAV5的轉導效能最佳。在本研究中，我們通過給雄性SD大鼠的DRG直接注射不同血清型腺相關病毒(AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)載體，發(fā)現(xiàn)AAV9對DRG初級感覺神經(jīng)元的轉染效能最佳。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)AAV9對雄性SD大鼠DRG神經(jīng)元的轉導效能最佳，為后續(xù)外周神經(jīng)系統(tǒng)的研究以及臨床基因治療提供了有力證據(jù)。