尚艷姣 周小軍 郭子瀟 袁 征

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心，北京 100071)

乳腺在激素的刺激下可分泌乳汁，乳腺發(fā)育障礙影響泌乳功能。影響小鼠乳腺發(fā)育的原因主要有兩方面，一方面是激素，包括雌激素、催乳素、孕激素和它們的下游旁分泌效應(yīng)子[1]，催乳素和雌激素協(xié)同促進(jìn)導(dǎo)管延伸、分叉和小葉腺泡形成。激素分泌不足，直接影響乳腺管的生長發(fā)育及乳腺末端的分枝，從而使乳腺發(fā)育受到影響。另一方面，除了經(jīng)典的激素調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育，還有生長因子、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞外基質(zhì)分子和蛋白酶也參與這個重要過程[2]。雙調(diào)蛋白(amphiregulin, Areg)是乳腺導(dǎo)管的延伸最重要的旁分泌介導(dǎo)者[3]。Areg 敲除小鼠在青春期乳腺導(dǎo)管發(fā)育受阻。

iRhom2Uncv小鼠是我單位培育的一種BALB/c遺傳背景的突變小鼠[4]。該小鼠純合子表型之一為毛囊分化障礙。前期研究工作表明iRhom2Uncv純合子的雌鼠乳腺側(cè)枝導(dǎo)管發(fā)育障礙，喪失泌乳功能，但相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究擬對iRhom2Uncv小鼠乳腺組織的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對影響乳腺發(fā)育障礙相關(guān)的基因進(jìn)行鑒定和功能分析，為深入研究iRhom2Uncv小鼠表型特征以及延展該小鼠模型在其他領(lǐng)域的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級iRhom2Uncv和野生型小鼠為本中心生產(chǎn)繁育。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2017-0014。

1.2 樣品采集

各取5只12周齡的野生型(WT)和iRhom2Uncv純合雌鼠，彎頭鑷夾取小鼠眼球，EP管收集血液，用于ELISA分析。其中3只采用斷頸法處死后迅速解剖，取新鮮乳腺組織進(jìn)行whole-mounts染色分析。另一部分新鮮乳腺組織放入RNase-free的離心管中，在液氮中速凍后置于-80 ℃保存，用于轉(zhuǎn)錄組分析。

1.3 Whole-mounts染色

將上述新鮮乳腺組織鋪在玻片上，用體積比1∶3的冰醋酸/100%乙醇混合物固定、水化，0.2%洋紅(Sigma)和0.5%的AlK(SO4)2過夜染色，在梯度乙醇中脫水，用體積比1∶2的苯甲醇/苯甲酸芐酯(Sigma)透明，利用Olympus IX51顯微鏡下觀察和拍照。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析

轉(zhuǎn)錄組測序由諾禾致源公司進(jìn)行，具體步驟包括：利用RNeasy mini kit(Qiagen)提取野生型和iRhom2Uncv小鼠乳腺組織總RNA，用Oligo Magnetic Beads分離mRNA，隨后將其打斷成250～300 bp的短片段，以片段化的RNA為模板，隨機(jī)寡核苷酸為引物合成cDNA第一條鏈。采用NEBNext Ultra TM RNA Library Prep Kit(New England Biolabs)構(gòu)建文庫，質(zhì)檢合格后，在Illumina Hiseq X ten平臺進(jìn)行PE150測序。下機(jī)原始數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾、測序錯誤率檢查及GC含量分布檢查，獲得有效測序數(shù)據(jù)(clean reads)。采用Tophat2將有效測序數(shù)據(jù)比對到小鼠參考基因組上，利用Stringtie拼接轉(zhuǎn)錄本，并對其進(jìn)行表達(dá)水平定量。最后用Cuffdiff軟件分析表達(dá)差異的顯著性，P<0.05為顯著差異。

1.5 ELISA分析

采用美國Bio Vision的Prolactin(mouse/rat)ELISA Kit(cat. No K4688)和Estrogen(mouse)ELISA Kit 10/16(cat. No K4265-100)測定小鼠血清中的催乳素和雌激素水平。

2 結(jié)果

2.1 乳腺發(fā)育形態(tài)

Whole-mounts染色分析結(jié)果顯示，相比于野生型小鼠(圖 1A)，出生12周iRhom2Uncv雌鼠的乳腺導(dǎo)管分叉較稀疏(圖 1B)，導(dǎo)管側(cè)枝發(fā)育明顯存在障礙。

圖1 小鼠乳腺形態(tài)注：A.野生型；B.iRhom2UncvFig.1 Mammary glands whole mounts of iRhom2Uncv and WTNote: A. wild type；B. iRhom2Uncv

2.2 差異基因的表達(dá)分析

計算FPKM的大小衡量基因表達(dá)水平的高低，用Cuffdiff軟件分析差異表達(dá)情況，以表達(dá)差異倍數(shù)[log2(Fold Change)] >1，P<0.05作為篩選條件。iRhom2Uncv小鼠和野生型小鼠乳腺組織共得到725個差異表達(dá)的基因，476個基因表達(dá)下調(diào)，249個基因表達(dá)上調(diào)。以多重假設(shè)檢驗校正后的P值(padj)小于0.05 [即-log10(padj)>1.3]作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，得到18個顯著性表達(dá)差異的基因，其中6個在 iRhom2Uncv小鼠中表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，12個在iRhom2Uncv小鼠中表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)(圖2)。Prl3b1、Prl2b1、Prl8a9基因?qū)儆诖呷樗丶易?，這3個基因在iRhom2Uncv小鼠中不表達(dá)，log2(Fold Change)分別為-12.02716、-11.47758 和-10.35361(表1)。Mfsd2a和Zfp281基因在iRhom2Uncv小鼠中表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05), 此外還有6個基因在iRhom2Uncv小鼠中也不表達(dá)。在表達(dá)上調(diào)的基因中，5個基因在野生型小鼠中不表達(dá)，而在iRhom2Uncv小鼠中表達(dá)量增加，且Mouse ENCODE transcriptome data顯示Olfr365在睪丸中的FPKM為0.21，在其他組織中不表達(dá)。

表1 差異基因列表Table 1 The list of different expression genes between iRhom2Uncv and WT

2.3 ELISA驗證

血清中的催乳素和雌激素檢測結(jié)果如圖3所示，iRhom2Uncv小鼠幾乎不產(chǎn)生催乳素，顯著低于野生型小鼠(P=0.006)，而雌激素水平高于野生型小鼠(P=0.037)。

圖3 野生型和iRhom2Uncv小鼠血清中的催乳素和雌激素水平Fig.3 Expression level of prolactin and estrogen in the serum of WT and iRhom2Uncvmice

3 討論

Uncv小鼠是我單位培育出的一種BALB/c遺傳背景的突變小鼠[5-6]，該小鼠純合子表型之一為毛囊分化障礙。通過基因定位、基因組掃描和克隆測序鑒定未知Uncv突變基因為iRhom2, 命名為iRhom2Uncv [6]。iRhom2Uncv突變?yōu)槿笔Х且拼a突變，缺失區(qū)域定位在iRhom2的N末端，長度為309 bp。缺失區(qū)域移碼區(qū)域編碼氨基酸在各物種間高度保守。過表達(dá)iRhom2轉(zhuǎn)基因小鼠與iRhom2Uncv交配后挽救iRhom2Uncv的毛囊分化障礙表型，證實導(dǎo)致iRhom2Uncv小鼠表型是由于iRhom2 N末端缺失引起[6]。另外，iRhom2 N末端對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的TNFα 轉(zhuǎn)化酶(TNFα-converting enzyme, TACE)成熟是必須的，iRhom2Uncv突變?yōu)楣δ軉适蛔僛6]。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)iRhom2Uncv雌鼠乳腺發(fā)育障礙，喪失泌乳功能，但其機(jī)制尚不明確。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，在iRhom2Uncv小鼠中有3個催乳素家族的基因不表達(dá)，且血清中也幾乎檢測不到催乳素表達(dá)。催乳素可以通過內(nèi)分泌和自分泌/旁分泌途徑影響乳腺上皮細(xì)胞的發(fā)育，可直接作用于乳腺上皮細(xì)胞，或者通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5b(Stat5b)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活間接作用于黃體，進(jìn)而通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5a(Stat5a)途徑影響乳腺發(fā)育[7]。

iRhom2 與TACE相結(jié)合，促進(jìn) TACE 離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體上進(jìn)行加工成熟[8-9]。雙調(diào)蛋白是乳腺導(dǎo)管的延伸最重要的旁分泌介導(dǎo)者，TACE可在上皮細(xì)胞表面剪切Areg，激活基質(zhì)細(xì)胞的表皮生長因子受體(EGFR)信號通路影響乳腺側(cè)枝形態(tài)發(fā)生。前期的研究結(jié)果顯示，野生型 iRhom2 能夠促進(jìn) TACE 的成熟，然而過表達(dá)iRhom2Uncv卻不能誘導(dǎo)TACE 的成熟。我們推測iRhom2Uncv小鼠乳腺發(fā)育障礙可能與不能誘導(dǎo)TACE 的成熟有關(guān)。

本研究通過比較iRhom2Uncv小鼠和野生型小鼠乳腺組織的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，共發(fā)現(xiàn)725個差異表達(dá)基因(P<0.05)，包括476個下調(diào)基因和249個上調(diào)基因，為了更好地控制假陽性率，我們以padj<0.05作為差異顯著的篩選條件，共篩選出18個差異顯著的基因，包括6個上調(diào)基因和12個下調(diào)基因，同時對這些基因進(jìn)行了文獻(xiàn)調(diào)研和功能分析。在iRhom2Uncv小鼠中Zfp281基因顯著下調(diào)，Zfp281基因編碼的是鋅指蛋白281。鋅指蛋白沒有固定的結(jié)構(gòu)和作用，一般在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，蛋白折疊與裝配以及 DNA、RNA 識別等分子功能基礎(chǔ)上，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、機(jī)體免疫及腫瘤形成、發(fā)展等過程[10]。目前可見一些鋅指蛋白與乳腺發(fā)育相關(guān)，如Zfp157、Zfp289和ZNF503。Zfp157是乳腺轉(zhuǎn)錄因子Stat 6的下游靶點，在外胚層中表達(dá)，青春期后，Zfp157主要在導(dǎo)管的基底上皮細(xì)胞和毛囊的皮脂腺中表達(dá)[10]。Zfp289可能是堿性螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子的顯性負(fù)調(diào)控因子(Id-1)誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞增殖的重要介質(zhì)[11]。ZNF503是GATA結(jié)合蛋白3(GATA3)表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄抑制因子，可誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳腺癌的發(fā)生[12]。但目前未發(fā)現(xiàn)Zfp281與乳腺發(fā)育相關(guān)的研究，但在胚胎干細(xì)胞中，Zfp281可與胚胎干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子Nanog啟動區(qū)的位點結(jié)合直接激活Nanog的表達(dá)，并且Zfp281同時具有激活域和抑制域，對胚胎干細(xì)胞的增殖、更新和多能性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著雙重作用[13]。我們推測iRhom2Uncv小鼠乳腺發(fā)育障礙可能與Zfp281下調(diào)有關(guān)。

此外，Zfp281可以調(diào)控X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)分子2(XRCC2)和4(XRCC4)的轉(zhuǎn)錄激活，通過調(diào)控不同修復(fù)機(jī)制基因的表達(dá)參與DNA損傷修復(fù)[14]。骨髓細(xì)胞瘤癌基因(myelocytomatosis oncogene，c-Myc)誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)依賴于Zfp281的表達(dá)，Zfp281的轉(zhuǎn)錄受SRY盒轉(zhuǎn)錄因子4(SRY-box transcription factor 4，SOX4)控制，SOX4在許多人類惡性腫瘤中表達(dá)，影響關(guān)鍵生長因子、發(fā)育途徑和癌癥進(jìn)展。Zfp281的轉(zhuǎn)錄也受到miR34a通過p53依賴機(jī)制的抑制[14]?？梢奪fp281在腫瘤中具有重要的生物學(xué)功能，iRhom2Uncv小鼠可能具有不同于野生型小鼠的腫瘤發(fā)生或發(fā)展表型。

Zfp281也是神經(jīng)元分化的調(diào)控因子，在小鼠皮層神經(jīng)元終末分化和維甲酸誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)細(xì)胞分化過程中，Zfp281的表達(dá)減少，而異位表達(dá)Zfp281，可以抑制小鼠皮層神經(jīng)元和NB細(xì)胞的分化[15]。在iRhom2Uncv小鼠中Mfsd2a和Grm3顯著下調(diào)，Mfsd2a(主要促進(jìn)因子超家族成員2a)是跨膜蛋白和鈉依賴性溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)運體，是血腦屏障形成和維持完整性的關(guān)鍵組成部分[16-18]。Grm3是編碼代謝型谷氨酸受體3的基因，谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可激活離子型和代謝型谷氨酸受體。谷氨酸能神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)中最為重要的興奮性神經(jīng)元，谷氨酸能神經(jīng)介質(zhì)參與了正常大腦功能的大部分方面[19-21]，在許多神經(jīng)病理學(xué)條件下可能受到干擾。iRhom2Uncv小鼠中嗅覺受體365(Olfr365)和碳酸酐酶10(Car10)顯著上調(diào)，嗅覺受體與鼻子中的氣味分子相互作用，啟動神經(jīng)反應(yīng)，從而觸發(fā)嗅覺[22]。嗅覺受體通過7個跨膜結(jié)構(gòu)與許多神經(jīng)遞質(zhì)和激素受體結(jié)合，識別氣味信號和G蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Car10可能在分泌途徑中與神經(jīng)突起形成復(fù)合物，促進(jìn)神經(jīng)突起的表面運輸[23]。催乳素參與運動對慢性應(yīng)激性記憶鞏固障礙的保護(hù)調(diào)節(jié)[24]。這些差異表達(dá)的基因在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的作用，同時研究發(fā)現(xiàn)iRhom在果蠅中主要在神經(jīng)組織表達(dá)。我們推測，iRhom2Uncv小鼠可能具有不同于野生型小鼠的神經(jīng)發(fā)育表型，其是否能應(yīng)用于腫瘤生物學(xué)或神經(jīng)生物學(xué)動物模型的建立需要進(jìn)一步研究。