李 春，劉 娟，張石楠，李玥曉，胡耀燕，李艷紅

（1）昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院第一門診部；2）昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔預防科，云南昆明 650101）

口腔是一個有菌環(huán)境，有其特有的口腔微生態(tài)系統(tǒng)。齲病、牙周病、牙髓根尖周病是口腔常見的細菌感染性疾病，在本質(zhì)上是菌群生態(tài)失衡性疾病，需生態(tài)防治[1]。蘆薈作為天然的可食用植物藥，其取材方便、經(jīng)濟實惠、毒副作用小、安全性高，具有調(diào)節(jié)免疫、抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)血糖、促進傷口愈合、抗癌、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用[2]。近年來，蘆薈在口腔疾病防治中的作用備受關注，目前其在口腔中的應用，多見于治療粘膜病[3]。蘆薈對口腔細菌的抑制作用雖然已有報道，但其對齲病、牙髓病、根尖周病、牙周炎等常見口腔細菌感染性疾病的相關優(yōu)勢菌的抑菌活性研究，仍然缺乏系統(tǒng)性研究報告。本研究探討蘆薈對齲病等口腔細菌感染性疾病的臨床藥用價值，采用體外實驗，測定其對口腔臨床常見病原菌模式株和臨床分離株（共21 株）的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

陰性對照組：不含藥液的瓊脂平皿；陽性對照組：藥物濃度分別為：20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL 的丁香含藥瓊脂平皿；實驗組：藥物濃度分別為：20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的蘆薈含藥瓊脂平皿。

1.2 實驗藥物及藥物實驗液的準備

1.2.1 實驗藥物貯存液配制將蘆薈研磨后，用高壓法配制實驗藥物儲存液，各取1 g 蘆薈、丁香加入5 mL 無菌蒸餾水，混合均勻后將試管置于高壓鍋內(nèi)，121℃、15 min（所配置藥物濃度為200 mg/mL）。

1.2.2 藥物實驗液的配制取蘆薈、丁香藥物儲存液（藥物濃度：200 mg/mL），用無菌BHI 肉湯培養(yǎng)基（英國OXID）對倍稀釋，配制實驗溶液，濃度呈對倍遞減，分別為100、50、25、12.5、6.25 mg/mL，置4℃冰箱保存。

1.3 含藥瓊脂平皿的配制

培養(yǎng)基選用BHI 瓊脂（英國OXID），并加入維生素K1-Hemin 溶液。分別取蘆薈、丁香藥物儲存液和藥物實驗液和溫度為45℃～55℃的BHI培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂混合，傾注于無菌培養(yǎng)皿中，冷卻后備用。藥物實驗液用量為2 mL，分別配置成含蘆薈、丁香藥物濃度分別為：20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL 的含藥瓊脂平皿，冷卻后備用。

1.4 實驗菌株及實驗菌液的準備

1.4.1 實驗菌株選取與齲病，牙體牙髓病和牙周病相關的21 株病原菌作為實驗菌株，細菌名稱及菌株號如下。

變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）7 株，其中模式株1 株，為ATCC25175；臨床分離株6 株，分別為Sm27、Sm29、Sm516、Sm572、Sm583、Sm593；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus）1 株：4356；內(nèi)氏放線菌（Actinomyces naeslundii，A.naeslundii）1 株：ATCC12104；粘性放線菌（Actinomyces viscosus，A.viscosus）1 株：ATCC15987；變黑普雷沃菌（Prevotella nigrescens），P.nigrescens.）1 株：ATCC32567；中間普雷沃菌（Prevotella intermedius，P.intermedius）1 株：ATCC25611；洛氏普雷沃菌（Prevotella loescheii，P.loescheii）1 株：ATCC15930；具核擬桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn).nucleatum）1 株：ATCC25586；牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）1 株：模式株ATCC33277；產(chǎn)黑色素的G-無芽胞厭氧桿菌（BPB）臨床分離株6 株：M-1、M2-1-1、M2-7-6、M6-7、M11-2、M13-7；質(zhì)控菌株為脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）ATCC25285。

1.4.2 實驗菌液的準備在BHI 瓊脂表面接種實驗菌株，厭氧培養(yǎng)48 h（80%N2+10%CO2+10%H2），取48 h 純培養(yǎng)物接種于BHI 肉湯并厭氧培養(yǎng)48 h（80%N2+10%CO2+10%H2），校正菌液濃度為0.5 McFarland（1.5×108cell/mL）備用。

1.5 MIC 值測定

采用瓊脂稀釋法（Agar dilution method）測定蘆薈對21 株口腔臨床常見病原菌優(yōu)勢菌的體外抗菌活性，用最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）表示。該方法是美國國立實驗室標準化委員會（national committee for clinical laboratory standards，NCCLs）推薦的厭氧菌藥物敏感試驗（Antimicrobial susceptibility testing of anaerobes）。取實驗菌液（細菌濃度：1.5×108cell/mL），點種于不同濃度的含藥瓊脂平皿表面，厭氧培養(yǎng)48 h（80%N2+10%CO2+10%H2）后，讀取MIC 值。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析：分別使用卡方檢驗和配對t檢驗對兩組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

陰性對照組中（空白組），所有實驗細菌均生長良好，陽性對照組、實驗組藥物水溶液的MIC值可納入結果分析，見表1、表2。

使用卡方檢驗對蘆薈、丁香對10 株致齲菌的MIC 值進行分析，結果顯示蘆薈組對10 株致齲菌的MIC 值高于丁香組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

使用配對t檢驗對蘆薈、丁香對表2 結果進行統(tǒng)計分析，結果顯示蘆薈對牙髓炎、根尖周炎和牙周病病原菌的MIC 值明顯低于丁香組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。

表1 蘆薈、丁香對10 株致齲菌的MIC 值（mg/mL）Tab.1 The MIC values of Aloe and Syzygium aromaticum to 10 strains of cariogenic bacteria（mg/mL）

表2 蘆薈、丁香對11 株牙髓炎、根尖周炎和牙周病病原菌的MIC 值（mg/mL）Tab.2 The MIC values of Aloe and Syzygium aromaticum to 11 strains of pathogenic bacteria involved in pulpitis，apicitis and periodontitis（mg/mL）

圖1 蘆薈、丁香對11 株牙髓炎、根尖周炎和牙周病病原菌的MIC 值（mg/mL）Fig.1 The MIC values of Aloe and Syzygium aromaticum to 11 strains of pathogenic bacteria involved in pulpitis，apicitis and periodontitis與蘆薈組比較，**P＜0.01。

3 討論

齲病、牙髓炎、根尖周炎、牙周病是最常見的口腔細菌感染性疾病，其發(fā)生與疾病的核心微生物組中的優(yōu)勢致病菌以及整個口腔微生態(tài)密切相關[4-5]。其中，與齲病相關的優(yōu)勢菌有變異鏈球菌、韋榮菌屬、放線菌屬、普雷沃菌屬等；與牙髓炎、根尖周炎相關的優(yōu)勢菌有產(chǎn)丙酸丙酸桿菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普雷沃菌、口腔普雷沃菌等；與牙周病相關的優(yōu)勢菌有牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體和福賽斯坦納菌、擬桿菌、隱藏真桿菌等[6]。本研究選擇的21 株實驗細菌中，包括了該幾種口腔常見細菌感染性疾病的主要致病優(yōu)勢菌。

蘆薈，是百合科蘆薈屬多年生肉質(zhì)草本植物，藥用歷史悠久，因其具有清肝熱、通便等功效，傳統(tǒng)醫(yī)學用于治療便秘、皮炎、潰瘍等[7]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈化學成分復雜，含有蒽醌類化合物、糖類、氨基酸、脂類、礦物質(zhì)和酶等多種有效成分[8]。藥理作用有抗菌、抗炎、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖等，現(xiàn)代臨床醫(yī)學應用中，常用其治療傷口愈合、糖尿病、口腔潰瘍、艾滋病等疾病。

蘆薈在口腔疾病防治中的應用，多見于治療口腔粘膜病，如：復發(fā)性阿弗他潰瘍和扁平苔蘚、口腔黏膜下纖維性變、放射性口腔黏膜炎、灼口綜合征等[3]。蘆薈對口腔感染性疾病的作用研究多見于使用蘆薈成品制劑，如蘆薈凝膠、蘆薈漱口水等。迄今，蘆薈對口腔細菌的抑菌作用，已見以下體外和體內(nèi)研究報道。Fani M 等[9]體外研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈凝膠對分離自齲病患者的致齲菌（變異鏈球菌）、牙周病患者的牙周致病菌（伴放線放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌）和機會性牙周致病菌（脆弱類擬桿菌）均有抑制作用，其中對變異鏈球菌最為敏感，由此推測蘆薈凝膠可用于預防齲齒和牙周疾病。劉云青等[10]發(fā)現(xiàn)，蘆薈對感染根管內(nèi)的常見優(yōu)勢菌有明顯的抑菌效果：牙髓卟啉單胞菌（MIC=15.6 mg/mL）、中間普雷沃菌（MIC=15.6mg/mL）、金黃色葡萄球菌（MIC=31.25mg/mL）、大腸桿菌（MIC=31.25mg/mL）、鏈球菌（MIC=7.81mg/mL），提示蘆薈可以作為根管內(nèi)封藥的候選藥物。體內(nèi)研究有：Prueksrisakul T 等[11]發(fā)現(xiàn)蘆薈凝膠可以顯著減少健康志愿者口腔內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量。Patri G 等[12]對齲病患者進行無創(chuàng)傷修復治療（ART），在去腐后，用蘆薈凝膠進行窩洞消毒，可減少窩洞內(nèi)的微生物計數(shù)，提示蘆薈可以有效地用作窩洞消毒劑。Al-Maweri SA 等[13]發(fā)現(xiàn)，蘆薈可有效減少牙菌斑指數(shù)和牙齦炎癥。上述研究結果顯示，蘆薈可能對口腔細菌感染性疾病的預防和治療有益。然而，已有研究結果中，缺乏其對口腔細菌性疾病的致病優(yōu)勢菌的抑菌活性的系統(tǒng)性研究報告。

本研究測定的21 株病原優(yōu)勢菌株中，既含有實驗穩(wěn)定性強而具有代表性的模式株，又含有能反映臨床實際感染狀況的臨床分離株，充分探討蘆薈的抑菌作用，使得研究結果更能體現(xiàn)臨床治療中的實用價值。同時，將前期實驗中抑菌活性較好的丁香[14]作為陽性對照組，探討蘆薈的抑菌活性更有進一步研究的指導意義。研究結果顯示，蘆薈對21 株口腔臨床常見病原菌均有不同程度的抑制作用：蘆薈對10 株致齲菌的MIC 值為＞20 mg/mL；對11 株牙髓炎、根尖周炎和牙周病的常見病原菌的MIC 值范圍為1.25～2 mg/mL，提示蘆薈對牙髓炎、根尖周炎、牙周病的常見病原菌的抗菌作用強于其對致齲菌的抗菌作用；與陽性對照組（丁香）相比，蘆薈對10 株致齲菌的抑制效應弱于丁香；但對牙髓炎、根尖周炎和牙周病病原菌具有更好的抑制效果。對比2 組結果，可發(fā)現(xiàn)蘆薈和丁香針對不同的口腔細菌各有優(yōu)勢，臨床使用時應根據(jù)不同口腔感染選擇此兩種藥物，從而達到更好的療效。蘆薈能發(fā)揮抑菌作用可能是因為其含有蒽醌類化合物，蒽醌類化合物的結構與四環(huán)素的結構類似，從而可能具有與四環(huán)素相同的作用機制，能抑制細菌肽鏈的增長和影響細菌蛋白質(zhì)合成，從而達到抑菌、抗菌的目的[15]。

此外，將本實驗結果與課題組前期研究結果[16]相比較，發(fā)現(xiàn)蘆薈抗菌活性弱于蘇木，但較麗江山慈菇、滇龍膽、訶子、龍血竭、杜仲等中藥更強，推測蘆薈對口腔細菌感染性疾病，尤其是對牙髓炎、根尖周炎和牙周病的防治具有潛在的藥用價值，值得提取其有效成分進行深入研究。