何麗，劉林，林長高，隗黎麗

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330045

隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，由水體富營養(yǎng)化引起的藍(lán)藻水華不僅會惡化水質(zhì)，更為嚴(yán)重的是，藍(lán)藻細(xì)胞死亡后所釋放的藻毒素可富集于水生生物體內(nèi)，隨后通過食物鏈的傳遞危害人類健康[1]。在眾多藻毒素中，微囊藻毒素(microcystins, MCs)為毒性最強(qiáng)、分布范圍最廣的毒素之一，其主要由微囊藻屬(Microcystis)、魚腥藻屬(Anabaena)、念珠藻屬(Nostoc)、束絲藻屬(Aphanizomenon)以及顫藻屬(Oscillatoria)等藍(lán)藻產(chǎn)生[2-3]。MCs進(jìn)入機(jī)體內(nèi)依靠多種有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transporting polypeptides, OATPs)的轉(zhuǎn)運(yùn)，研究顯示，OATPs在肝臟、腎臟、性腺和腦等組織中均存在表達(dá)[4]。因此，MCs能進(jìn)入肝臟、腎臟、性腺及腦組織中而發(fā)揮其肝毒性[5]、腎毒性[6]、生殖毒性[7]及神經(jīng)毒性[8]作用。

自噬在所有真核生物的進(jìn)化上高度保守，是細(xì)胞內(nèi)一種重要的溶酶體依賴性降解機(jī)制[9]。根據(jù)內(nèi)容物質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w途徑的不同，細(xì)胞自噬可以分為微自噬(microautophagy)、分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone mediated autophagy, CMA)和巨自噬(macroautophagy)[10]。微自噬是溶酶體膜直接內(nèi)陷吞噬胞質(zhì)成分，而分子伴侶介導(dǎo)的自噬是在分子伴侶(HSC70)的作用下溶酶體降解含有KFERQ序列的可溶性胞質(zhì)蛋白底物[11]。巨自噬即通常所說的自噬，是指具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體(autophosome)包裹著胞漿成分與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autopholysome)，最終胞漿成分被溶酶體酶降解的過程?；A(chǔ)水平的自噬能清除細(xì)胞內(nèi)衰老細(xì)胞器及長壽蛋白以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[12]。然而，過低或過高水平的細(xì)胞自噬都會導(dǎo)致細(xì)胞不可逆死亡即Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death Ⅱ, PCDⅡ)[13]。本文就MCs誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，并總結(jié)其可能存在的誘導(dǎo)機(jī)制，以期為進(jìn)一步明確自噬在MCs的細(xì)胞毒性中發(fā)揮的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 微囊藻毒素及其毒性機(jī)制(Microcystins and their mechanisms of toxicity)

MCs是一類相對分子質(zhì)量在800～1 100 Da之間的單環(huán)七肽化合物，其主要由非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases, NRPSs)、聚酮合成酶(polyketide synthases, PKSs)和其他雜合酶等多功能蛋白復(fù)合體合成[14]。該化合物的結(jié)構(gòu)通式為環(huán)(D-Ala1-L-X2-D-isoMeAsp3-L-Z4-Adda5-D-isoGlu6-Mdha7)，其中，2、4號位的X、Z為2種可變的L型氨基酸[15-16]。在已鑒別的100多種MCs異構(gòu)體中，MC-LR、MC-RR和MC-YR為分布廣泛且毒性較強(qiáng)的3種異構(gòu)體，其中L、R和Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸[17]。MCs理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸堿、紫外線輻射及高溫，常規(guī)處理方法(如混凝、沉淀、絮凝和過濾等)很難有效去除水體中的MCs[18]。因此，MCs對水體環(huán)境和人群健康的危害已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境問題。

2 微囊藻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的研究(Studies on autophagy induced by microcystins)

現(xiàn)有報(bào)道主要以肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、性腺細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞為研究對象，開展了MCs誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的研究。下面將主要從MCs對不同細(xì)胞自噬的影響以及機(jī)制進(jìn)行綜述。

2.1 微囊藻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬

2.1.1 微囊藻毒素誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬

肝臟是MCs作用的靶器官，主要是由于肝臟中存在多種高表達(dá)的OATPs，如OATPl Bl、OATPl B3和OATPl A2等，MCs在這些OATPs的主動轉(zhuǎn)運(yùn)作用下進(jìn)入肝細(xì)胞，造成嚴(yán)重的肝損傷[27]。大量報(bào)道表明，MCs可導(dǎo)致哺乳類[28-29]、魚類[30-31]和兩棲類[32]等動物肝臟超微結(jié)構(gòu)和多種酶活性的改變，并誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡或壞死，從而導(dǎo)致機(jī)體肝功能障礙。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)MCs在造成肝細(xì)胞損傷的同時啟動了細(xì)胞自噬。如Dabholkar和Carmichael[33]發(fā)現(xiàn)MC-LR除了可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體腫大、空泡化及脂滴的形成之外，還誘導(dǎo)了含顆粒狀物質(zhì)或碎片的自噬泡的產(chǎn)生，推測MC-LR誘導(dǎo)了肝細(xì)胞自噬。Menezes等[34]將人肝癌(HepG2)細(xì)胞暴露于MC-LR(6、12和25 mg·L-1)24 h后，利用透射電鏡可觀察到MC-LR誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬體的產(chǎn)生，但數(shù)量隨著濃度的增加而減少，而高濃度MC-LR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及壞死顯著增加。吳珍等[35]在飲用水中添加MC-LR對小鼠染毒3個月，發(fā)現(xiàn)MC-LR誘導(dǎo)的小鼠肝臟自噬相關(guān)基因LC3α轉(zhuǎn)錄水平的增加與線粒體膜電位的下降存在相關(guān)性，認(rèn)為在線粒體膜電位消失的同時，細(xì)胞啟動了自我保護(hù)機(jī)制。由以上報(bào)道可知，MCs可誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬的發(fā)生。

2.1.2 微囊藻毒素誘導(dǎo)腎細(xì)胞自噬

研究表明，腎臟中也存在多種OATPs，致使MCs容易造成腎臟損傷[36]。非洲綠猴腎(Vero-E6)細(xì)胞經(jīng)5、20和40 mg·L-1MC-LR(LMECYA113提取物)脅迫24、48和72 h后，MC-LR對Vero-E6細(xì)胞溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和細(xì)胞骨架的損傷具有時間-劑量依賴性，低濃度的MC-LR能誘導(dǎo)Vero-E6細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體自噬，而較高濃度則會導(dǎo)致Vero-E6細(xì)胞凋亡及壞死[37]。Menezes等[34]將Vero-E6細(xì)胞分別經(jīng)6、12、25和50 mg·L-1MC-LR (LMECYA110提取物)暴露24 h，發(fā)現(xiàn)低濃度MC-LR誘導(dǎo)Vero-E6細(xì)胞自噬，而高濃度主要導(dǎo)致Vero-E6細(xì)胞壞死。綜上所述，MC-LR能誘導(dǎo)腎細(xì)胞自噬且自噬水平與MC-LR的濃度有關(guān)。

2.1.3 微囊藻毒素誘導(dǎo)性腺細(xì)胞自噬

MC-LR可作為一種內(nèi)分泌干擾物造成機(jī)體生殖系統(tǒng)功能紊亂而影響動物機(jī)體的繁殖、生長和發(fā)育[38]，而細(xì)胞自噬與MC-LR的生殖毒性密切相關(guān)。Adegoke等[39]報(bào)道MC-LR可引起牛睪丸支持(Sertoli)細(xì)胞線粒體損傷并誘導(dǎo)線粒體自噬。Chen等[26]利用不同濃度MC-LR對大鼠Sertoli細(xì)胞染毒后，發(fā)現(xiàn)低濃度MC-LR能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，而高濃度MC-LR可通過影響溶酶體的功能而導(dǎo)致自噬體堆積，隨后下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平促進(jìn)Sertoli細(xì)胞凋亡。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MC-LR可顯著抑制中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)CHO細(xì)胞自噬[40]。在Liu等[41]的研究中，不同濃度(8.5、17和34 mg·L-1)MC-LR可促進(jìn)小鼠卵巢顆粒(KK-1)細(xì)胞內(nèi)ATG5、ATG12、Beclin1及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的蛋白表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

2.1.4 微囊藻毒素誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬

MC-LR具有神經(jīng)毒性，可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織[8]。慢性MC-LR暴露可引起小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡、記憶喪失和學(xué)習(xí)障礙，從而引起阿爾茨海默病樣癥狀[42]。研究顯示，自噬在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要的調(diào)控作用，而MC-LR誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的研究也有相應(yīng)報(bào)道。為確定MC-LR誘導(dǎo)的自噬是否為神經(jīng)毒性的潛在機(jī)制，Yang等[43]利用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SK-N-SH)細(xì)胞經(jīng)15 mg·L-1和30 mg·L-1MC-LR處理48 h后，發(fā)現(xiàn)MC-LR可顯著抑制SK-N-SH細(xì)胞活性，自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和p62表達(dá)的升高均呈濃度依賴性，此外，與對照組相比，MC-LR處理組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度顯著升高，認(rèn)為由MC-LR引起的細(xì)胞存活率降低可能與自噬通量的抑制和細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的增加有關(guān)。對神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞進(jìn)行MC-LR(1、25和50 mg·L-1)染毒24 h后，發(fā)現(xiàn)MC-LR處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，線粒體膜電位顯著降低，線粒體自噬相關(guān)基因PINK1和Parkin表達(dá)呈劑量依賴性上升，推測MC-LR通過氧化應(yīng)激激活PINK1/Parkin線粒體自噬，參與MC-LR致PC12細(xì)胞損傷[44]。然而，MC-LR引發(fā)的自噬在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機(jī)制還有待深入研究。

2.2 微囊藻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機(jī)制

細(xì)胞自噬發(fā)生過程由多種蛋白參與，首先機(jī)體受到刺激后在ULK1-ATG13-ATG101和Beclin1-Vps34蛋白復(fù)合物的作用下自噬體成核延伸，隨后在ATG12-ATG5-ATG16L1和ATG8(LC3)-PE這2個泛素結(jié)合系統(tǒng)的參與下形成自噬體，最終通過相關(guān)蛋白識別機(jī)制與溶酶體融合形成自噬溶酶體進(jìn)行底物降解[45]。該過程受多條上游信號通路的調(diào)控，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通過AMPK-mTORC1、PI3K/AKT/mTORC1和Ras/ERK/RSK/mTORC1等信號通路調(diào)控自噬相關(guān)蛋白ULK1復(fù)合物，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)自噬水平[46]。Beclin1(酵母Atg6同源物)信號通路在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，Beclin1蛋白中BH3(Bcl-2-homology3)、中央螺旋區(qū)(CCD)和進(jìn)化保守區(qū)(ECD)3個結(jié)構(gòu)域可與其他因子如Bcl-2/XL、DAPK、Mst1、JNK1和ClassⅢ PI3K等相互作用，影響細(xì)胞自噬[47]。而P53作為一個主要的抑癌基因，可通過調(diào)控AMPK和Akt/mTOR通路及ATG12的表達(dá)來調(diào)節(jié)自噬[48]。此外，細(xì)胞應(yīng)激通路也參與細(xì)胞自噬的調(diào)控[49]。其中，細(xì)胞應(yīng)激通路主要包括線粒體氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激2條途徑。目前，認(rèn)為MCs對細(xì)胞自噬效應(yīng)的誘導(dǎo)主要通過誘發(fā)細(xì)胞應(yīng)激而實(shí)現(xiàn)，即與線粒體氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑有關(guān)。

2.2.1 線粒體氧化應(yīng)激途徑

2.2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)參與細(xì)胞內(nèi)如蛋白質(zhì)合成與修飾、多肽鏈折疊、鈣代謝和脂代謝等多種生物學(xué)功能[57-58]。當(dāng)機(jī)體受到刺激(有毒物質(zhì)等)時，因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERs)產(chǎn)生過多的未折疊或錯誤折疊的蛋白致使機(jī)體啟動未折疊蛋白反應(yīng)(unfold protein reaction, UPR)[59]。UPR主要由存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3個跨膜分子PERK(pancreatic ER kinase-PKR-like kinase)、ATF6(activating transcription factor 6)、IRE1(inositol-requiring enzyme 1)參與調(diào)控。目前，越來越多的研究表明PERK、ATF6和IRE1與自噬的發(fā)生密不可分[60]。證據(jù)表明，PERK-eIF2α-ATF4途徑及PERK-AMPK-mTORC途徑參與ERs介導(dǎo)的細(xì)胞自噬[61-62]。其中，PERK-eIF2α-ATF4途徑可激活一系列自噬相關(guān)基因(autophagy related genes, ATGs)包括LC3B、ATG3、ATG7、ATG10、ATG12、ATG16L1和Beclin1等的表達(dá)而促進(jìn)自噬[63]。此外，IRE1-JNK/XBP1-Beclin1途徑誘導(dǎo)的自噬也得到了驗(yàn)證[64]。而ERs可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)Ca2+平衡紊亂，誘導(dǎo)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而激活mTOR和AMPK等自噬上游信號通路[65]。為探討ERs與自噬之間的關(guān)系，Zhang等[40]分別應(yīng)用MC-LR聯(lián)合ERs抑制劑4-PBA或自噬抑制劑3-MA共同處理CHO細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，抑制ERs后，自噬標(biāo)志性蛋白Beclin1 和LC3 Ⅱ表達(dá)降低，LC3 Ⅰ表達(dá)升高，而細(xì)胞凋亡率明顯下降；抑制自噬后，ERs標(biāo)志蛋白如GRP78、ATF6、PERK、IRE1和CHOP表達(dá)升高而細(xì)胞凋亡率顯著增加。由此可知，ERs是MC-LR誘導(dǎo)自噬的重要因素之一，ERs促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而自噬作為保護(hù)機(jī)制能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Liu等[41]的研究結(jié)果表明，MC-LR能夠通過上調(diào)ERs相關(guān)蛋白eIF2α、CHOP、XBP-1、GRP78及PERK和自噬相關(guān)蛋白ATG16、ATG12、ATG5、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ及Beclin1的表達(dá)，誘導(dǎo)KK-1細(xì)胞ERs和自噬，推測MC-LR誘發(fā)的ERs可通過PERK/eIF2α/ATG12和XBP-1/Beclin1信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，而細(xì)胞經(jīng)NAC預(yù)處理后，MC-LR通過下調(diào)上述蛋白的表達(dá)抑制ERs和自噬，這表明氧化應(yīng)激介導(dǎo)了MC-LR誘導(dǎo)的ERs，隨后通過ERs相關(guān)途徑調(diào)控自噬。然而ERs在MCs誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的具體信號調(diào)控機(jī)制有待今后進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論及展望(Conclusions and prospects)

目前，水質(zhì)惡化日趨嚴(yán)重，廣泛存在于水體中的MCs備受人們關(guān)注，因此，深入研究MCs的毒性機(jī)理及自噬在機(jī)體受MCs脅迫時發(fā)揮的具體作用具有重要意義。研究表明，MCs能夠通過線粒體氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激2種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，細(xì)胞自噬可能是機(jī)體應(yīng)對MCs毒性的早期反應(yīng)，通過自噬清除受損細(xì)胞器以提高細(xì)胞的生存，而隨著暴露時間延長及暴露濃度的上升，細(xì)胞凋亡及壞死被誘導(dǎo)。

目前針對MCs誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的研究已逐漸開展，但還存在很多不足，今后可從以下幾個方面進(jìn)行深入研究。(1)現(xiàn)階段的研究主要集中于高等哺乳動物，而要真正全面地揭示調(diào)控MCs誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機(jī)制，還需對長期暴露于MCs中的低等水生生物如魚類等進(jìn)行更深入細(xì)致的研究。(2)現(xiàn)有研究表明，MC-LR的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑基因的多態(tài)性可以影響毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，導(dǎo)致MC-LR暴露機(jī)體敏感性存在差異，從而致使MC-LR進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的毒性作用存在差異[5,66]，這可能是目前MC-LR誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的研究主要集中在肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、生殖細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等上，而還未在其他組織細(xì)胞深入開展的原因之一。因此，后續(xù)可以從MC-LR是否誘導(dǎo)其他不同組織細(xì)胞自噬以及誘導(dǎo)機(jī)制是否存在差異等方面進(jìn)行探索，以期全面剖析MC-LR的毒性機(jī)理。(3)MCs種類繁多，已鑒定的100多種異構(gòu)體之間存在差異，而目前的研究主要針對MC-LR對動物機(jī)體的影響，而其他種類MCs的毒性作用機(jī)理的異同尚未可知。(4)自噬的調(diào)控機(jī)制錯綜復(fù)雜，而現(xiàn)有MCs誘導(dǎo)細(xì)胞自噬機(jī)制的研究主要針對自噬體形成過程，其上游調(diào)控信號通路及自噬溶酶體的降解途徑未見詳細(xì)報(bào)道，對自噬流的研究尚不系統(tǒng)，且自噬在機(jī)體受MCs脅迫時具體發(fā)揮的作用以及途徑還需進(jìn)一步研究。