張 偉

(威海市中醫(yī)院，山東 威海 264200)

研究顯示，CD4+T細(xì)胞分化失衡是導(dǎo)致哮喘氣道炎癥的重要因素，其中Th1、Th2引起的免疫失衡理論是比較經(jīng)典的理論。在Th0向Thl、Th2分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3是重要因子，其中T-bet是2000年首次報(bào)道的一種新的轉(zhuǎn)錄因子[1]，僅在胸腺細(xì)胞和Thl細(xì)胞中選擇性表達(dá)，GATA-3為Th分化所必需且僅在Th2中表達(dá)[2]。Th17[3]是2005年新發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞亞群，它以分泌IL-17為主，并介導(dǎo)以中性粒細(xì)胞升高為主的哮喘， ROR-γt[4]是中性粒細(xì)胞哮喘過程中特異性轉(zhuǎn)錄因子。

據(jù)文獻(xiàn)分析[5-6]，通過對各項(xiàng)肺功能指標(biāo)如最大通氣量、靜息通氣量、補(bǔ)呼氣容積、深吸氣量、肺活量、潮氣量等檢測得出結(jié)論，艾灸是文獻(xiàn)中治療哮喘出現(xiàn)次數(shù)較多、出現(xiàn)頻率較高的技術(shù)手段。哮喘屬于灸法獨(dú)立干預(yù)的優(yōu)勢病種之一。據(jù)實(shí)驗(yàn)研究顯示[7-9]，懸灸療法不僅改善哮喘大鼠行為學(xué)評分和病理狀態(tài)，而且提高血清中的IFN-γ/IL-4，進(jìn)一步改善Th1/Th2，減少氣道內(nèi)炎癥的反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)擬研究ROR-γt、GATA-3、T-bet轉(zhuǎn)錄因子與中性粒細(xì)胞哮喘、嗜酸細(xì)胞哮喘的特異相關(guān)性，并探討懸灸對2種哮喘的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

75只SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量180 g～210 g，購自斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司(合格證編號43004700026841)，包括A組(正常組)、B組(中性粒模型組)、C組(中性粒懸灸組)、D組(嗜酸粒模型組)、E組(嗜酸粒懸灸組)，每組各15只。

1.2 主要試劑和儀器

10%卵白蛋白(OVA,Sigma)，T-bet一抗、GATA-3一抗、ROR-γt一抗、β-actin 抗體、二抗羊抗鼠(均由中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)； Real time PCR mastermix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(由TransGenBiotech提供)；PCR引物(上海生工)，Trizol(Invitrogen公司)，脂多糖(Sigma)。超聲霧化器(魚躍醫(yī)療)，凝膠成像分析系統(tǒng)、分光光度儀、高速冷凍離心機(jī)(均購自Thermo Fisher Scientific公司)，Real time PCR儀(Applied biosystems)。

1.3 造模方法

中性粒細(xì)胞哮喘[10]：致敏：第1、8天先腹腔注射麻醉(3%戊巴比妥鈉、30 mg/kg)，豎頸，開放氣道，用移液器將脂多糖滴入鼻孔至氣道(2 mg/kg)，并腹腔注射10%OVA(100 mg/kg)；激發(fā)：2周后霧化吸入1%OVA引發(fā)哮喘，中等霧量，每天20 min，持續(xù)霧化2周。

嗜酸細(xì)胞哮喘[11]：致敏：第1、8天腹腔注射10%OVA(100 mg/kg)；激發(fā)：2周后霧化吸入1%OVA引發(fā)哮喘，中等霧量，20 min/d，持續(xù)霧化2周。正常組均使用滅菌注射用水代替，步驟同前。

1.4 治療方法

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]取穴。膻中：兩乳連線中點(diǎn)，平第4、5肋間；肺俞：T3胸椎下兩旁；脾俞：T11胸椎下兩旁；腎俞：S2腰椎下兩旁。艾灸方法：將艾條(長12 cm、直徑1 cm)于腧穴上方約2 cm處，先做回旋灸、雀啄灸、循經(jīng)往返灸等以溫通經(jīng)脈、激發(fā)經(jīng)氣，時(shí)長約5 min，然后于穴位處固定施行溫和灸。開始介入治療時(shí)間為實(shí)驗(yàn)的第15天，每日1次，每次40 min，每次于霧化引喘前30 min結(jié)束，共14次。

1.5 樣品采集及指標(biāo)檢測

1.5.1 大鼠肺組織中ROR-γt、T-bet、GATA-3蛋白測定(免疫組織化學(xué)法) 取右肺下葉石蠟包埋，切片脫蠟，一抗孵育、顯色，二抗孵育，復(fù)染封片。每個(gè)樣本于高倍視野(10×40)下隨機(jī)選取20個(gè)互不重疊視野，測定平均吸光度值。采用Image-Pro Plus分析軟件進(jìn)行分析。

1.5.2 肺組織中ROR-γtmRNA、T-betmRNA、GATA-3mRNA的表達(dá)測定(RT-PCR技術(shù)) 表1顯示，取右肺下葉組織，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。PCR反應(yīng)，條件：93 ℃，30 s(93 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)，電泳。根據(jù)RQ=2-△△Ct算mRNA相對表達(dá)量。

表1 各轉(zhuǎn)錄因子引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

圖1表2示，經(jīng)免疫組化法及RT-PCR法檢測，與正常組比較，中性粒模型組、嗜酸粒模型組各因子蛋白及mRNA表達(dá)皆有非常顯著性升高(P<0.01)。與嗜酸粒模型組比較，中性粒模型組ROR-γt蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)，而GATA-3、T-bet蛋白及mRNA表達(dá)又顯著降低(P<0.01)。經(jīng)懸灸治療后，中性粒懸灸組與模型組比較、嗜酸粒懸灸組與模型組比較，各因子的蛋白及mRNA表達(dá)均有非常顯著性降低(P<0.01)。由上得出，ROR-γt因子與中性粒細(xì)胞哮喘有高度的相關(guān)性，而因子GATA-3、T-bet與嗜酸細(xì)胞哮喘的發(fā)作有密切相關(guān)性；懸灸可以通過對靶點(diǎn)ROR-γt、GATA-3、T-bet的干預(yù)，從而減輕氣道中性粒細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞的含量。

表2 各組肺組織中ROR-γt、GATA-3、T-bet蛋白及mRNA表達(dá)比較

注：與A組比較:▲▲P<0.01；與B組比較:●●P<0.01；與C組比較:■■P<0.01；與D組比較:□□P<0.01

圖1 各組肺組織中ROR-γt、GATA-3、T-bet表達(dá)免疫組化染色圖只鼠/組)

3 討論

以Th2介導(dǎo)的嗜酸粒細(xì)胞增多引發(fā)哮喘的理論是經(jīng)典的免疫學(xué)理論。但后來發(fā)現(xiàn)，嗜酸粒細(xì)胞增多并不能解釋所有的哮喘呼吸道炎性反應(yīng)，Th17細(xì)胞及其介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞性炎癥與哮喘也密切相關(guān)。核孤兒受體-γt(ROR-γt)[13-14]不僅誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Th17分化，而且在分化成熟的Th17細(xì)胞內(nèi)特異性高表達(dá)。當(dāng)ROR-γt缺陷時(shí)，組織浸潤和募集炎癥細(xì)胞能力降低，炎癥性疾病癥狀減輕[15]；此外，GATA-3、T-bet是Th細(xì)胞分化調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。GATA-3是Th2高表達(dá)的特異因子，在Th0向Th2分化過程中，GATA-3基因自身活化并促使正在分化或已分化的Th向Th2分化。干擾素γ(IFN-γ)與T-bet密切相關(guān)[16]。IFN-γ與受體結(jié)合后，激活T-bet基因，激發(fā)Th細(xì)胞向Thl方向分化；而T-bet也可反向促進(jìn)IFN-γ的激活，使IFN-γ的等位基因位點(diǎn)變異。所以，通過T-bet對IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄的直接調(diào)控，可能觸發(fā)Th細(xì)胞向Thl方向分化。由此可見，ROR-γt、GATA-3和T-bet可能是Th17、Th2、Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子，對于Th細(xì)胞的分化起到至關(guān)重要的作用。通過干預(yù)ROR-γt、GATA-3和T-bet的表達(dá)，對調(diào)控Th的分化、控制哮喘氣道炎癥可能起到關(guān)鍵作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，免疫組化法、RT-PCR法測得的ROR-γt、GATA-3和T-bet表達(dá)量說明2種哮喘模型中上述3種轉(zhuǎn)錄因子皆有高表達(dá)，而中性粒模型組以高表達(dá)ROR-γt為主，而嗜酸粒模型組以高表達(dá)GATA-3和T-bet為主；經(jīng)懸灸肺俞、脾俞、腎俞、膻中后，中性粒懸灸組與模型組比較、嗜酸粒懸灸組與模型組比較，3種轉(zhuǎn)錄因子皆有非常顯著性降低。

綜上說明，Th細(xì)胞在分化過程中有特定轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控及高表達(dá)，其中ROR-γt轉(zhuǎn)錄因子的高表達(dá)主要引發(fā)中性粒細(xì)胞哮喘，而GATA-3、T-bet的高表達(dá)則引起嗜酸粒細(xì)胞哮喘的發(fā)生；通過懸灸治療可以調(diào)節(jié)ROR-γt、GATA-3、T-bet的表達(dá)，從而降低哮喘的氣道炎癥反應(yīng)。