楊 琳，王海峰，張 紅，黨秋萍

1.陜西省楊凌示范區(qū)醫(yī)院(楊凌 712100)；2.武警陜西總隊(duì)醫(yī)院(西安 710054)；3.陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

清心安神丸源于陜西省中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科協(xié)定處方，主要由黃連、川芎、梔子等14味藥物組成，有較好的寧心除煩，養(yǎng)陰安神療效。方中黃連清熱燥濕、川芎活血行氣止痛、梔子瀉火除煩，是除煩安神的主藥[1-3]。為了控制好制劑質(zhì)量，確保其臨床療效，我們對(duì)其分別進(jìn)行了定性定量分析，為清心安神丸的質(zhì)量控制提供了參考。

資料與方法

1 儀 器 Agilent Technologies 1260 InfinityⅡ,1260VWD檢測(cè)器，Control Panel工作站，超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)、電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司，d=0.1 mg、d=0.01 mg)。

2 試 藥 清心安神丸(陜西省中醫(yī)醫(yī)院制備，批號(hào)：180401、180402、180403)；黃連、川芎、梔子苷(均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：120913-201310、120918-201110、110713-201212、110749-201718)；甲醇購(gòu)自Fisher公司，其它試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，制劑所用藥材購(gòu)自陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科。

3 薄層色譜鑒別

3.1 黃連：取本清心安神丸樣品4 g，研細(xì)，加甲醇30 ml，超聲提取30 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液[4-7]。再按上述方法制備缺黃連的陰性對(duì)照溶液。對(duì)照品采用黃連對(duì)照藥材：黃連對(duì)照藥材溶液(取樣量為0.25 g)，按上述方法制備。取上述3種溶液，點(diǎn)于硅膠G板上，點(diǎn)樣量為2 μl，展開(kāi)劑為：環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)，展開(kāi)前用濃氨溶液預(yù)飽和20 min，紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果：清心安神丸樣品色譜中檢出黃連，陰性對(duì)照無(wú)干擾(圖1)。

3.2 川芎：取本清心安神丸樣品6 g，研成細(xì)粉，加乙醚30 ml，加熱回流1 h，濾過(guò)，揮干乙醚，殘?jiān)右宜嵋阴? ml使溶解，作為供試品溶液[8-9]。再按上述方法制備缺川芎的陰性對(duì)照溶液，另取川芎對(duì)照藥材1 g，按上述方法制成川芎對(duì)照藥材溶液。分別吸取樣品溶液、陰性對(duì)照溶液和對(duì)照藥材溶液各10 μl，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑：正己烷-乙酸乙酯(3∶1)，置紫外光燈(254 nm)下檢視。結(jié)果清心安神丸供試品色譜中檢出川芎，陰性對(duì)照無(wú)干擾(圖2)。

3.3 梔子：取本清心安神丸樣品13 g，粉碎成細(xì)粉，至錐形瓶中，加甲醇40 ml超聲20 min，放涼濾過(guò)，濾液水浴蒸干，加水20 ml溶解，用水飽和的正丁醇提取，蒸干，加無(wú)水乙醇適量溶解后與3 g中性氧化鋁拌勻，加于中性氧化鋁柱頂(內(nèi)徑d=1 cm，長(zhǎng)12 cm)，用30 ml甲醇洗脫，收集，水浴蒸干，加1 ml甲醇溶解，作為供試品溶液[10-12]。再按上述方法制備缺梔子的陰性對(duì)照溶液。以梔子苷對(duì)照品甲醇溶液(4 mg /1 ml)為對(duì)照。分別取樣品溶液、陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液各2 μl，點(diǎn)于硅膠G薄層板，展開(kāi)劑：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)溶液置于冰箱中，冷藏過(guò)夜，取下層溶液作為展開(kāi)劑展開(kāi)，顯色劑用10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱顯色至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果顯示，清心安神丸供試品色譜中檢出梔子苷，陰性對(duì)照無(wú)干擾(圖3)。

4 HPLC法測(cè)定梔子苷含量

4.1 梔子苷對(duì)照品溶液：精密稱取梔子苷對(duì)照品5.1 mg，加100 ml甲醇溶解(0.051 mg/ml)，備用。

4.2 樣品及陰性對(duì)照品溶液：取清心安神丸適量，粉碎成細(xì)粉，精密稱取1.25 g，置錐形瓶中，精密加甲醇40 ml超聲20 min，放涼后用甲醇補(bǔ)重，搖勻?yàn)V過(guò)，精密量取10 ml續(xù)濾液，水浴蒸至約1 ml，與1 g中性氧化鋁拌勻，干燥，加于中性氧化鋁柱頂(內(nèi)徑d=1 cm，長(zhǎng)12 cm)，以70%甲醇50 ml洗脫，收集，水浴蒸干，加甲醇轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，加溶劑至刻度，搖勻?yàn)V過(guò)備用。同法制備陰性樣品溶液。

4.3 色譜條件：Kromasil C18色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-水(30∶70)；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm。理論塔板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算大于3000[13]。

4.4 陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：分別取樣品溶液、陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液各10 μl，按上述色譜條件檢測(cè)，結(jié)果：清心安神丸樣品HPLC圖譜中，梔子苷色譜峰分離良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾(圖4-6)。

結(jié) 果

1 線性關(guān)系考察 精密量取上述梔子苷對(duì)照品溶液，分別精密吸取2、4、6、8、10 μl，測(cè)定。結(jié)果：梔子苷在 0.102～0.510 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=2147.2X-0.2277，r =0.9999(Y：峰面積，X：進(jìn)樣量)。

2 精密度試驗(yàn) 取上述梔子苷對(duì)照品溶液10 μl，濃度為0.051 mg/ml，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果梔子苷峰面積RSD為0.79%。

3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 上述供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，測(cè)得梔子苷含量RSD為1.23%，表明該方法重現(xiàn)性良好，在樣品中含量為0.5049 mg/g。

4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取新制備的供試品溶液10 μl，測(cè)定10 h內(nèi)穩(wěn)定性(每隔2 h測(cè)定1次)，結(jié)果梔子苷峰面積RSD在10 h內(nèi)為0.595%。

5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取清心安神丸(含量為0.505 mg/g)細(xì)粉六份，每份約0.6 g，分別加入梔子苷對(duì)照品溶液(0.051 mg/ml)4.8、4.8、6、6、7.2、7.2 ml，按樣品溶液制備方法處理，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 梔子苷回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

6 樣品測(cè)定 取三批樣品，按上述樣品制備方法處理樣品，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 清心安神丸樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

討 論

黃連的薄層鑒別試驗(yàn)，黃連藥材中含有[14]：①生物堿類：黃連堿、巴馬丁、藥根堿、小檗堿、表小檗堿等生物堿類，在黃連總生物堿中含量高達(dá)80%左右，主要是原小檗堿型，其中小檗堿為黃連主要成分。還有一些生物堿類只存在于少量的品種中，并且含量不高，比如甲基黃連堿、木蘭堿等。②脂類：從黃連植物中分離得到了反式阿魏酸對(duì)羥基苯乙酯和落葉松脂素。③多糖類。鹽酸小檗堿是黃連藥材中主要有效成分，因此以黃連、鹽酸小檗堿為對(duì)照，對(duì)方中黃連進(jìn)行鑒別。按正文方法進(jìn)行試驗(yàn)，供試品色譜中，各斑點(diǎn)顯色清晰，分離度良好，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；再按處方比例和樣品制備工藝制成缺黃連陰性對(duì)照樣品，按正文方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果陰性對(duì)照未見(jiàn)干擾，故將該方法收入標(biāo)準(zhǔn)正文。

川芎的薄層鑒別試驗(yàn)，川芎藥材中含有[15]：①揮發(fā)性成分：藁本內(nèi)酯(Ligustilide，58.00%)、3-丁叉苯酞(3-butylidene,phthalide，5.29%)香檜烯(Sabinene，6.08%)，其它成分有：α-蒎烯(α-Pinene)、莰烯(Camphene)、月桂烯(Myrcene)。②苯肽衍生物：川芎內(nèi)酯(Cnidiumlactone)，川芎酚(Chuanxingol)。③雙苯肽衍生物：﹙Z，Z′﹚-二藁本內(nèi)酯[(Z，Z′)-diligustilide]等。④生物堿：川芎嗪(Chuanxiongzine)，佩洛立靈(Perlolyrine)，腺嘌呤和腺苷。⑤有機(jī)酸類：阿魏酸、棕櫚酸、葉酸、咖啡酸、原二茶酸、香草酸等。⑥有機(jī)酸酯類：苯乙酸甲酯、瑟丹酸內(nèi)酯、十五酸甲酯。川芎藥材成分復(fù)雜，特征性成分不明顯。因此以川芎藥材為對(duì)照，對(duì)方中川芎進(jìn)行鑒別。按正文方法進(jìn)行試驗(yàn)，供試品色譜中，各斑點(diǎn)顯色清晰，分離度良好，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；再按處方比例和樣品制備工藝制成缺川芎陰性對(duì)照樣品，按正文方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果陰性對(duì)照未見(jiàn)干擾，故將該方法收入標(biāo)準(zhǔn)正文。

梔子的薄層鑒別試驗(yàn)，梔子藥材中含有[16]：①環(huán)烯醚萜類，如梔子苷,京尼平苷(Geniposide)、京尼平龍膽二糖苷(Genipingentiobioside)、京尼平苷酸(Geniposidic acid)；②西紅花苷類，如西紅花苷，西紅花酸；③另外還含有黃酮類成分。梔子苷是梔子藥材中主要有效成分，因此以梔子苷為對(duì)照，對(duì)方中梔子進(jìn)行鑒別。方法一：參照(《中國(guó)藥典》2015年版一部)梔子鑒別項(xiàng)下的方法，取本品13 g，研細(xì)，加50%甲醇20 ml，超聲處理40 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取梔子苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液6 μl，對(duì)照品溶液2 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開(kāi)劑,展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，略顯相同顏色的斑點(diǎn)，且分離度不理想。方法二：參照(《中國(guó)藥典》2015年版一部)瀉肝安神丸鑒別梔子項(xiàng)下的方法，即正文方法。按正文方法進(jìn)行試驗(yàn)，供試品色譜中，各斑點(diǎn)顯色清晰，分離度良好，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；再按處方比例和樣品制備工藝制成缺梔子陰性對(duì)照樣品，按正文方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果陰性對(duì)照未見(jiàn)干擾，故將該方法收入標(biāo)準(zhǔn)正文。

含量測(cè)定指標(biāo)選擇：在清心安神丸含量測(cè)定之前，對(duì)指標(biāo)的選定進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，首先對(duì)處方中的君藥生地黃、臣藥梔子的含量測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生地黃中梓醇成分由于保留時(shí)間過(guò)小(在5 min以內(nèi))，無(wú)法與樣品中雜質(zhì)峰分開(kāi)，故不能用作質(zhì)量控制指標(biāo)。梔子為臣藥，梔子苷含量測(cè)定經(jīng)預(yù)試發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相簡(jiǎn)單，樣品分離度好，峰形理想。故最終選擇梔子藥材中的梔子苷作為制劑質(zhì)量控制指標(biāo)。

色譜條件選擇：梔子為方中臣藥，梔子苷為其主要

有效成分，因此采用HPLC法建立其含量測(cè)定方法，檢測(cè)波長(zhǎng)采用《中國(guó)藥典》中“梔子”項(xiàng)下波長(zhǎng)，流動(dòng)相采用甲醇與水溶液，對(duì)比例進(jìn)行反復(fù)調(diào)整，以拖尾因子、分離度、理論塔板數(shù)、基線作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，最終選取甲醇-水(30∶70)為流動(dòng)相[17]。并進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果顯示，精密度、重現(xiàn)性及回收率均良好，樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定，可用于清心安神丸中梔子苷的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

提取溶劑選擇：考察60%、70%、80%甲醇作為洗脫劑時(shí)梔子苷的含量分別為0.4646、0.4937、0.4942 mg/g。由此可見(jiàn)用80%甲醇洗脫和用70%甲醇洗脫梔子苷得量差別不大，故選擇用70%甲醇洗脫。

綜上所述，本研究建立了清心安神丸中黃連、川芎、梔子的TLC鑒別方法，并對(duì)該制劑中梔子苷含量進(jìn)行測(cè)定并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了考察。本研究所建立定性定量鑒別方法簡(jiǎn)單，專屬性、耐用性好，可用于清心安神丸的質(zhì)量控制。