張 偉，林 海，常 翔，楊 琳，呂富榮，左 瑞，田 兵

西安市中醫(yī)醫(yī)院腦病科(西安 710021)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)的病理表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)致密部的多巴胺能(Dopaminergic,DA)神經(jīng)元顯著減少，而殘存的 DA神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體即路易小體，其主要成分為α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)[1]。除遺傳因素外，氧化應(yīng)激和線(xiàn)粒體功能障礙被認(rèn)為是PD演變的核心環(huán)節(jié)[2-4]。PD屬于中醫(yī)“顫證”范疇，肝腎陰虛貫穿疾病始終，早期以痰熱動(dòng)風(fēng)、血瘀動(dòng)風(fēng)、肝腎陰虛多見(jiàn)，中期以肝腎陰虛為主，晚期則以肝腎陰虛、陰陽(yáng)兩虛常見(jiàn)[5]。柔筋止顫片由西安市中醫(yī)醫(yī)院腦病科自制院內(nèi)制劑，該藥主要由鉤藤、珍珠母、龍骨、牡蠣、川牛膝、天麻、白芍、甘草等九味藥組成，具有柔肝息風(fēng)，止痙通絡(luò)的功效。經(jīng)過(guò)近30年的臨床使用，發(fā)現(xiàn)其對(duì)帕金森病的具有一定的療效。本實(shí)驗(yàn)旨在探討柔筋止顫片是否能通過(guò)抑制ROS通路保護(hù)由MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞損傷，為其進(jìn)一步研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 細(xì)胞培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)選用人源神經(jīng)母瘤細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞[6]。培養(yǎng)條件為：溫度37℃，CO2含量5%。用于培養(yǎng)細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基(Sigma，美國(guó))中含有10%胎牛血清(GIBCO，美國(guó))。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞密度需要達(dá)到50%。

2 MTT檢測(cè) MTT(Millipore，美國(guó))檢測(cè)用于檢測(cè)細(xì)胞活性。分組：①正常對(duì)照組：不處理；②柔筋止顫片組：柔筋止顫片(25 nmol/L)處理24 h；③MPP+組：MPP+(500 μmol/L)處理24 h；④柔筋止顫片+MPP+組：柔筋止顫片(25 nmol/L)預(yù)處理24 h后，經(jīng)MPP+(500 μmol/L)處理。采用96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，依組處理后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。將培養(yǎng)基清除后，每孔加入150 μl二甲亞砜(DMSO)，避光置入酶標(biāo)儀讀數(shù)器(Bio-Rad公司，美國(guó))，震蕩10 min后讀數(shù)，波長(zhǎng)設(shè)定為570 nm。細(xì)胞活性(%)=檢測(cè)組值/正常對(duì)照組值×100 %。

3 O2-檢測(cè) 采用DHE(D11347,Life Technologies，美國(guó))檢測(cè)O2-水平，分組同MTT檢測(cè)。采用96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，依組分別處理后，加入DHE(5 mmol/L)，室溫避光15 min，孵育完畢后用PBS洗3次，每次5 min，避光置入酶標(biāo)儀讀數(shù)器(Bio-Rad公司，美國(guó))進(jìn)行讀數(shù)。O2-比率(%)=檢測(cè)組值/正常對(duì)照組值×100 %。

4 ROS檢測(cè) 采用DCFH-DA(D6883,Life Technologies，美國(guó))檢測(cè)ROS水平，分組同MTT檢測(cè)。采用96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，依組處理后，加入DCFH-DA(10 μmol/L)，室溫避光15 min，孵育完畢后用PBS洗3次，每次5 min，避光置入酶標(biāo)儀讀數(shù)器(Bio-Rad公司，美國(guó))進(jìn)行讀數(shù)。ROS比率(%)=檢測(cè)組值/正常對(duì)照組值×100 %。

5 Western blot檢測(cè) 分組同MTT檢測(cè)，采用6孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，處理后的細(xì)胞經(jīng)PBS溶液(4℃)重復(fù)沖洗2次，每孔加入1 ml裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解。蛋白定量后，取15 μg總蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，置入2 % BSA溶液中，室溫下孵育2 h。將PVDF置入一抗Cleaved Caspase-3(9664，CST公司，美國(guó))，Cleaved Caspase-8(9748，CST公司，美國(guó))，Cleaved Caspase-9(52873，CST公司，美國(guó))，β-actin(3700，CST公司，美國(guó))中室溫(4 ℃)孵育過(guò)夜后，二抗室溫(4 ℃)繼續(xù)孵育2 h。采用全能型凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))進(jìn)行成像，Lab Image軟件(Kapelan GmbH，德國(guó))進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1 柔筋止顫片保護(hù)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞活性下降MPP+(500 μmol/L)處理后細(xì)胞活性下降至(53.21±12.11)%作為處理?xiàng)l件，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。研究發(fā)現(xiàn)，柔筋止顫片處理對(duì)于細(xì)胞活性沒(méi)有影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。柔筋止顫片預(yù)處理24 h后，經(jīng)MPP+處理，可以保護(hù)細(xì)胞活性維持于(96.78±17.24)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 柔筋止顫片減輕MPP+誘導(dǎo)的O2-和ROS增多 MPP+處理后O2-和ROS水平升高(3.87±1.01)倍和(4.02±0.53)倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。柔筋止顫片處理對(duì)于O2-和ROS水平?jīng)]有影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。柔筋止顫片預(yù)處理24 h后，經(jīng)MPP+處理，可以保護(hù)O2-和ROS水平降低至(1.11±0.19)倍和(1.24±0.23)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 柔筋止顫片調(diào)節(jié)MPP+誘導(dǎo)的Clevaed Caspase-3,Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-9表達(dá) MPP+處理后Clevaed Caspase-3,Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-9表達(dá)水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。柔筋止顫片處理對(duì)于Clevaed Caspase-3,Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-9表達(dá)水平?jīng)]有影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。柔筋止顫片預(yù)處理24 h后，經(jīng)MPP+處理，可以使Clevaed Caspase-3,Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-9表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 柔筋止顫片調(diào)節(jié)MPP+誘導(dǎo)的Clevaed Caspase-3,Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-9表達(dá)

討 論

在高表達(dá)突變蛋白α-Syn(A53T)的轉(zhuǎn)基因PD小鼠模型中，A53T能夠靶向性的聚集于線(xiàn)粒體膜上，并選擇性抑制線(xiàn)粒體復(fù)合體I功能，從而引起線(xiàn)粒體膜電位下降，造成ROS的生成過(guò)度增加[7]。作為與細(xì)胞核同樣具有自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能的mtDNA，由于缺少保護(hù)機(jī)制和自我修復(fù)機(jī)制，可直接被ROS損傷[8]。無(wú)法修復(fù)的線(xiàn)粒體則通過(guò)線(xiàn)粒體自噬進(jìn)行選擇性地清除，以保證細(xì)胞功能正常。而在PD中，自噬處于異常狀態(tài)，導(dǎo)致線(xiàn)粒體損傷處于持續(xù)的惡性循環(huán)中。

mtDNA雖然具有自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能，但由于缺少類(lèi)似于細(xì)胞核中組蛋白和DNA結(jié)合蛋白的保護(hù)機(jī)制和自我修復(fù)機(jī)制，其直接暴露于氧化磷酸化過(guò)程產(chǎn)生的ROS中，因此極易受到損傷而發(fā)生突變[9]。此外，由于mtDNA缺少內(nèi)含子，任何部位發(fā)生突變均可影響其所編碼的復(fù)合物及電子傳遞鏈的結(jié)構(gòu)和功能缺陷，而導(dǎo)致ROS生成增加，從而發(fā)生惡性循環(huán)[10]。

MPP+常用于PD細(xì)胞模型的建立，研究發(fā)現(xiàn)該品可導(dǎo)致線(xiàn)粒體損傷，并產(chǎn)生大量的包括NO、H2O2、NO-、O2-在內(nèi)的ROS[11]。我課題組研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化中藥單體(紅景天苷、白藜蘆醇)可保護(hù)MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞活性降低，并維持線(xiàn)粒體長(zhǎng)度和增加線(xiàn)粒體膜電位水平[12-16]，說(shuō)明中藥在保護(hù)神經(jīng)元免受神經(jīng)毒性侵襲中具有重大的潛力[17-20]。進(jìn)而，在本研究中發(fā)現(xiàn)，一方面柔筋止顫片預(yù)處理可以減少M(fèi)PP+誘導(dǎo)的細(xì)胞活性降低，另一方面柔筋止顫片可能通過(guò)維持線(xiàn)粒體形態(tài)和正常功能以降低MPP+誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體破損繼而引發(fā)的O2-和ROS水平升高。

當(dāng)細(xì)胞自身無(wú)法完成修復(fù)且維持正常功能時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞凋亡程序啟動(dòng)，并被鄰近的吞噬細(xì)胞所吞噬。而不管通過(guò)何種途徑，最終均需通過(guò)激活Caspases誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21-24]。內(nèi)源性途徑是以線(xiàn)粒體作為細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心，其損傷后釋放出的大量細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1及Caspase-9結(jié)合形成凋亡小體，而被活化的Ccaspase-9則繼而激活Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡[25-30]。外源性途徑則是以死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路，主要通過(guò)活化Caspases-8繼而激活Caspases-3，引起細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，柔筋止顫片預(yù)處理可以顯著降低MPP+誘導(dǎo)的Clevaed Caspase-9、Clevaed Caspase-8和Clevaed Caspase-3表達(dá)水平升高，提示柔筋止顫片可以通過(guò)抑制凋亡蛋白的活化以阻止細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行。

綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)柔筋止顫片可減少M(fèi)PP+誘導(dǎo)的O2-和ROS水平升高以減少線(xiàn)粒體的損傷，并減少Caspases蛋白的活化以抑制細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)，進(jìn)而保護(hù)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活性降低，為進(jìn)一步優(yōu)化柔筋止顫片的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。相關(guān)研究亦發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方在治療帕金森病方面具有確切療效[25]，但是由于中藥復(fù)方有效成分的復(fù)雜性，柔筋止顫片的有效成分分析需要進(jìn)一步驗(yàn)證。