倪 菲,于 睿,崔家鵬,王彩霞,袁東超,楊茗茜,李思琦,曲金橋

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院(沈陽 110847)；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院西醫(yī)診斷教研室(沈陽 110032)

中醫(yī)理論認(rèn)為脾為“后天之本，氣血生化之源”[1]，脾能化生人體的氣、血、精、津液，是由于脾從飲食中吸收營養(yǎng)物質(zhì)，使其輸布于五臟六腑，四肢百骸，即“脾主運(yùn)化”的功能。只有脾的運(yùn)化功能正常，人體才能進(jìn)行正常的物質(zhì)生成與代謝。中醫(yī)的“脾”不僅是指西醫(yī)的整個(gè)消化系統(tǒng)，而且與多系統(tǒng)、多功能單位有關(guān)。琥珀酸脫氫酶(SDH)是線粒體能量代謝三羧酸循環(huán)中不可缺少的酶，它在生物體內(nèi)可以起到催化琥珀酸脫氫從而轉(zhuǎn)變成延胡索酸的作用，并釋放出大量能量供機(jī)體使用。細(xì)胞色素氧化酶C(Cyt-C)，也被叫做呼吸鏈復(fù)合物，它位于呼吸鏈的末端，起到催化細(xì)胞色素氧化的作用，同時(shí)驅(qū)動(dòng)其合成，是線粒體的標(biāo)志酶，其酶活性的發(fā)揮對于維持各個(gè)部位線粒體結(jié)構(gòu)和功能以及細(xì)胞能量的產(chǎn)生有非常重要的意義[2]。香砂六君子湯具有益氣健脾的功效[3]，本研究主要觀察香砂六君子湯對脾氣虛證淺表性胃炎模型大鼠胃竇細(xì)胞組織里琥珀酸脫氫酶活性及細(xì)胞色素氧化酶C含量的影響，旨在從線粒體能量代謝角度闡明其治療脾氣虛證淺表性胃炎的作用機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司購買SPF級2月齡雄性健康SD大鼠45只(體重200±20 g)，許可證號為：SCXK(遼)2015-0001。所有大鼠均在購買后進(jìn)行分籠飼養(yǎng)1周，在不施加任何處理因素條件下給予自由飲水及飲食。動(dòng)物飼養(yǎng)每天按時(shí)給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。實(shí)驗(yàn)觀察室采取開放形式，溫度、照明、噪音與換氣等自然飼養(yǎng)條件均嚴(yán)格控制在規(guī)定范圍內(nèi)，每日定時(shí)進(jìn)行清洗。

2 主要試劑 SDH試劑盒(批號：BC0955)與大鼠Cyt-C定量檢測試劑盒(批號：BC0854)，均購于北京索萊寶科技有限公司。脫氧膽酸鈉粉末、2%水楊酸鈉溶液與4%多聚甲醛溶液均購自上海金穗生物科技有限公司。

3 儀器及設(shè)備 主要儀器采用的是:全自動(dòng)酶標(biāo)儀anthos2010(由奧地利安圖公司生產(chǎn))；UV-1801紫外/可見分光光度針(購自北京北分瑞利分析儀器公司)；臺式多功能冷凍高速離心機(jī)(Stratos，德國賽默飛公司生產(chǎn))；勻漿器；精密數(shù)字電子天平(SETRA，美國)；可調(diào)式移液器；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；恒溫震蕩器(杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn))、制冰機(jī)(SANYO公司生產(chǎn))、水浴鍋等。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 動(dòng)物分組及模型制備：45只大鼠隨機(jī)分為正常組(健康組)15只(以下簡稱正常組)、脾氣虛證淺表性胃炎模型組15只(以下簡稱模型組)、脾氣虛證淺表性胃炎模型治療組15只(以下簡稱治療組)。正常組蒸餾水灌胃，每只1 ml/100 g, 2次/d，連續(xù)30 d；模型組采用勞倦過度與饑飽失常加強(qiáng)酸刺激等復(fù)合因素塑造脾氣虛證淺表性胃炎模型，第1～20天每隔5天，灌胃濃度為2%水楊酸鈉溶液，每次每只3 ml，并將20 mmol/L的脫氧膽酸鈉溶液當(dāng)作飲料給大鼠們隨意飲用；而在第21～30天則分別將20 mmol/L的脫氧膽酸鈉2%和水楊酸鈉溶液當(dāng)作飲料交替進(jìn)行，每隔3天輪換1次，任意給大鼠們飲用，以加強(qiáng)刺激。與此同時(shí)，在第21～30天期間進(jìn)行感染幽門螺桿菌。每次感染前先禁食14～16 h，經(jīng)口腔緩慢灌注5%的NaHCO33 ml，15 min后灌注幽門螺桿菌菌液3 ml，40 min后給食。每隔5天感染1次，共進(jìn)行2次。實(shí)驗(yàn)第1～30天期間單日喂食甘藍(lán)。15～20 g/只，禁食，自由飲水；游泳至耐力極限(耐力極限系指大鼠游泳至口鼻部首次侵入水中)。雙日以豬油3 ml/只灌胃，自由進(jìn)食、飲水。治療組造模方法同上，共造模30 d。

4.2 脾虛大鼠模型的評估標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)衛(wèi)生部藥政司發(fā)布的《關(guān)于中藥治療脾虛證的臨床研究指導(dǎo)原則》中提到的診斷標(biāo)準(zhǔn)、1986年全國中西醫(yī)結(jié)合虛證老年病防治學(xué)術(shù)會(huì)議制定的“中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)”及《21世紀(jì)課程教材-中醫(yī)基礎(chǔ)理論》(李德新主編，2001年版)確定脾氣虛模型評估標(biāo)準(zhǔn)：①大便溏泄；②食少納呆；③消瘦，體重減輕；④神態(tài)萎靡，毛色無光澤；⑤蜷縮聚堆；⑥易疲勞。第①、②項(xiàng)為主癥，第③～⑥項(xiàng)為兼項(xiàng)，具備兩項(xiàng)主癥及兩項(xiàng)兼癥時(shí)，即可認(rèn)為脾氣虛造模成功。

4.3 藥物干預(yù)：治療組30 d后，以香砂六君子湯(黨參20 g，茯苓、白術(shù)各15 g，清半夏、陳皮、砂仁、炙甘草各10 g，木香5 g，根據(jù)國家炮制標(biāo)準(zhǔn)炮制后，煎煮成湯劑，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供)灌胃，4℃保存，用前加熱至37℃。每公斤體質(zhì)量大鼠的給藥量為人的6.3倍，并且每次給大鼠灌胃量為正常人給藥量的2倍劑量灌服[4]，早晚各1次，連續(xù)15 d。正常組和模型組灌服等量蒸餾水，方法同上。

5 指標(biāo)檢測

5.1 琥珀酸脫氫酶(SDH)活性指標(biāo)檢測：在實(shí)驗(yàn)45 d后每組大鼠各留取10只，于給藥結(jié)束后立即處死取材備檢。檢測前各組大鼠禁食16 h，采取吸入式麻醉后剖開腹腔，迅速剪取距幽門近端約2～3 cm的胃竇組織。各稱取1 g放入預(yù)冷的蒸餾水中洗去血液后，準(zhǔn)確稱量0.1 g胃竇組織加9倍生理鹽水后，用冰浴勻漿器充分研磨后制成10%的勻漿，4℃11000 g離心10 min后，按照試劑盒明確注明的方法提取上清液放置冰上進(jìn)行SDH活性檢測。

5.2 細(xì)胞色素氧化酶C(Cyt-C)含量檢測：采取吸入麻醉后，剖開大鼠腹腔，剪取距幽門近端約2～3 cm的胃竇組織，各稱取1 g放入預(yù)冷的蒸餾水中洗去血液后，加入一定量的PBS(pH7.4)。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2～8℃的溫度。在加入一定量的PBS之后(pH7.4)，用勻漿器將標(biāo)本進(jìn)行充分的勻漿處理。以2000～3000 r/min的速度離心20 min左右后注意仔細(xì)收集上清液按試劑盒說明方法進(jìn)行細(xì)胞色素氧化酶C含量檢測。

5.3 胃竇組織HE染色普通光鏡下觀察病理：大鼠吸入麻醉后，剖腹切取損傷嚴(yán)重的胃竇組織1 cm3,沿大鼠胃大彎處剪幵，平鋪，置入裝有生理鹽水的燒杯中洗滌2次，后用水沖洗干凈，切塊，投入4%多聚甲醛中固定24 h，20%和30%蔗糖梯度脫水，冰凍，切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，封片，于不同倍數(shù)光鏡下觀察胃黏膜改變。

結(jié) 果

1 脾氣虛大鼠模型建立的指標(biāo)觀察 脾氣虛造模大鼠，造模第5天開始，喂藥當(dāng)日就會(huì)出現(xiàn)軟便，次日自行恢復(fù)。隨著造模時(shí)間延長，喂藥當(dāng)日則會(huì)出現(xiàn)溏便，次日可以見到軟便。自造模15 d左右逐漸形成蜷縮聚堆，拱背，萎靡，毛發(fā)枯槁，納呆、怠惰，便溏，個(gè)別有黏液便，體重減輕，出現(xiàn)了脾氣虛證。22 d以后可見溏便臟尾，懶動(dòng)，毛枯槁無光澤，進(jìn)食減少，泄瀉，拱背，體重增長緩慢，以上表現(xiàn)持續(xù)至造模結(jié)束。本實(shí)驗(yàn)研究中脾氣虛組動(dòng)物出現(xiàn)各體征及表現(xiàn)與臨床脾氣虛證具有一定的相似性。正常組大鼠則毛色潤澤，進(jìn)食量大，體重呈自然上升趨勢，上述脾氣虛癥狀未出現(xiàn)。說明本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了脾氣虛證大鼠模型。

2 脾虛淺表性胃炎大鼠病理組織學(xué)觀察 正常組大鼠胃竇組織黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞呈單柱狀，腺體排列緊密規(guī)則，極少見到炎癥細(xì)胞浸潤；模型組胃黏膜上皮細(xì)胞受損，表現(xiàn)為排列紊亂，黏膜層可以觀察到有大量炎癥細(xì)胞浸潤，部分能看到有成堆的淋巴細(xì)胞聚集灶，而胃竇黏膜腺體則表現(xiàn)為排列紊亂；治療組大鼠胃黏膜的表面上皮細(xì)胞受損和炎癥細(xì)胞浸潤情況與模型組相比明顯減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠胃竇組織黏膜(HE染色，×100)

3 各組大鼠琥珀酸脫氫酶活性的比較 見表1。三組大鼠于45 d后處死，進(jìn)行檢測，測定胃竇組織的琥珀酸脫氫酶活性，從表1結(jié)果可見，模型組大鼠琥珀酸脫氫酶活性顯著低于正常組和治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組琥珀酸脫氫酶活性顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 大鼠胃竇組織琥珀酸脫氫酶活性比較(U/mgprot)

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05

4 各組大鼠細(xì)胞色素氧化酶含量的比較 見表2。從表2結(jié)果可見，模型組大鼠細(xì)胞色素氧化酶含量顯著低于正常組和治療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組細(xì)胞色素氧化酶含量顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 大鼠胃竇組織細(xì)胞色素氧化酶含量比較(nmol/L)

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05

討 論

慢性淺表性胃炎，又稱慢性非萎縮性胃炎，是一種由多種病因引起的胃黏膜的慢性淺表性炎癥[6]，主要臨床癥狀表現(xiàn)為上腹脹痛、灼熱感、噯氣、反酸、食欲減退等。屬于中醫(yī)“胃脘痛”范疇[7]。其發(fā)病與多種因素有關(guān)，如幽門螺桿菌(HP)感染、免疫因素、辛辣刺激飲食、藥物等，并且慢性淺表性胃炎發(fā)病時(shí)間長后極易發(fā)展成為慢性萎縮性胃炎[8]。西醫(yī)主要采取根除幽門螺桿菌感染、保護(hù)胃黏膜、抑制胃酸分泌、促進(jìn)胃腸動(dòng)力等方法治療。香砂六君子湯出自《古今名醫(yī)方論》，由四君子湯加半夏、陳皮、木香、砂仁而成[9]，具有補(bǔ)氣理胃，行氣化滯之功，同時(shí)也是臨床治療脾胃虛弱，氣機(jī)阻滯而變生胃痞的有效方劑[10]，屬補(bǔ)益劑范疇。目前臨床廣泛用于消化性潰瘍、漫性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎及功能性消化不良等[11]。方中黨參補(bǔ)脾胃之氣；白術(shù)健運(yùn)脾胃以助消化；半夏與陳皮降氣化痰；木香辛散溫通，化滯助運(yùn)；砂仁理氣和胃止嘔[12]。

如果從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來進(jìn)行分析，胃腸道中消化液的分泌，小腸對各類營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及胃腸平滑肌的自身運(yùn)動(dòng)均需要耗費(fèi)能量，而這些所需能量則主要是由線粒體對食物的氧化提供。人體全身的組織細(xì)胞當(dāng)中幾乎都存在著線粒體，線粒體是生物體內(nèi)細(xì)胞對食物進(jìn)行生物氧化作用，進(jìn)而不斷產(chǎn)生能量的重要細(xì)胞器，因此它又被稱為“ATP的生產(chǎn)基地”、或是“細(xì)胞的動(dòng)力站”。它在人體能量代謝系統(tǒng)中占有重要地位[13],這與中醫(yī)脾為“氣血生化之源”、“后天之本”的說法密切相關(guān)[14]。琥珀酸脫氫酶是線粒體的一種標(biāo)志酶，位于線粒體內(nèi)膜上的一種與內(nèi)膜相結(jié)合的酶，是連接呼吸電子之間傳遞和進(jìn)行氧化磷酸化的樞紐之一。除此之外，它還可以為多種原核細(xì)胞產(chǎn)生能量的呼吸鏈提供電子。由此我們可以說，SDH的活性增高也就代表著細(xì)胞內(nèi)的能量即ATP生成也隨之增強(qiáng)[15]。細(xì)胞色素氧化酶，也被叫做呼吸鏈復(fù)合物，它位于呼吸鏈的末端，起到催化細(xì)胞色素氧化的作用，同時(shí)驅(qū)動(dòng)其合成，也是線粒體的標(biāo)志酶，其酶活性的發(fā)揮對于維持各個(gè)部位線粒體結(jié)構(gòu)和功能以及細(xì)胞能量的產(chǎn)生有非常重要的意義和作用。脾主運(yùn)化的功能正常，則可以從飲食水谷中攝取精微以營養(yǎng)五臟六腑、四肢百骸，而各類營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，就是一個(gè)主動(dòng)消耗能量、不斷消耗ATP的過程。由此可以得出的結(jié)論是，脾主運(yùn)化功能的強(qiáng)弱與琥珀酸脫氫酶的活性與細(xì)胞色素氧化酶C的含量密切相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各組小鼠的體質(zhì)量并無明顯差異，糞便質(zhì)地、數(shù)量均正常。除正常組(健康組)外，其余各組小鼠于造模第8天開始就逐漸出現(xiàn)飲食量下降，毛發(fā)不光澤且稀疏，大便稀軟粘膩，肛周不潔，活動(dòng)頻率下降等表現(xiàn)。說明慢性淺表性胃炎在一定程度上可以引起身體消瘦，食欲不振的癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，香砂六君子湯可以顯著提高脾氣虛證淺表性胃炎大鼠胃竇組織琥珀酸脫氫酶的活性及細(xì)胞色素氧化酶C的含量，從而增強(qiáng)胃竇細(xì)胞線粒體的氧化供能作用，說明香砂六君子湯作為益氣和胃，行氣化滯之良方，具有較好的治療淺表性胃炎的作用，其作用機(jī)制可能是通過提高胃竇細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素氧化酶的含量及琥珀酸脫氫酶的活性實(shí)現(xiàn)的。