徐亞英 黃曉梅 謝麗

摘 要 通過單因素試驗對枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，為實現(xiàn)該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。試驗結(jié)果表明：該菌株培養(yǎng)基各組分的最佳配比為蛋白胨1%，麩皮∶酵母提取物（3∶2）為0.5%，氯化鈉1%。最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為初始pH值6.0，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時間為24 h、裝液量100 mL，接種量為4%，轉(zhuǎn)速為200 rpm·min-1。

關(guān)鍵詞 枯草芽孢桿菌;發(fā)酵條件;單因子試驗

中圖分類號：S432.2+2 文獻標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.20.071

農(nóng)田中許多病害嚴(yán)重發(fā)生，化學(xué)防治使病原菌的抗藥性增強、不斷分化出新的生理小種，同時造成藥物殘留，對食品安全造成隱患，破壞環(huán)境。目前，從微生物代謝物中篩選出防治有害生物的生防農(nóng)藥成為新農(nóng)藥研究的重要方向。生物農(nóng)藥具有高效低毒的優(yōu)點，越來越受到人類的青睞。

迄今為止，具有生物防治功能的細菌有100多種，我國和世界上許多國家已有商品化微生物農(nóng)藥產(chǎn)品。但是，多數(shù)菌劑在田間應(yīng)用過程中防效不穩(wěn)，制約微生物菌劑開發(fā)應(yīng)用。此外，多數(shù)研究只是針對某一種病害，具有廣譜抗性的菌株很少。

芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)使用的益生菌，對抗生素?zé)o耐藥性，對人畜無毒無害，綠色環(huán)保，對環(huán)境無污染，對作物安全，可產(chǎn)生多種抗生素，包括脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類等物質(zhì)，對多種動、植物與人類病原菌具有較好的抑制作用。而且該菌還具有很強的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶活性，并具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。

枯草芽孢桿菌作為有益的根際微生物，越來越得到人們的重視，目前在辣椒、玉米、黃瓜、水稻等農(nóng)作物的病害上具有較好的生防效果。其芽孢可以制成粉劑、添加劑等各種制劑應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)等各個方面。但是在目前的工業(yè)化生產(chǎn)中，常用的發(fā)酵方法中存在周期長、芽孢數(shù)含量低、成本高等諸多問題。因此，作為微生物制劑，枯草芽孢桿菌發(fā)酵工藝的研究對其應(yīng)用具有非常重要的意義。本試驗通過單因素篩選對該菌株的發(fā)酵工藝與條件進行優(yōu)化，為該菌株生防菌肥的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌由黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院分析檢測中心微生物實驗室篩選保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基均為LB，即蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，自然pH。

1.1.3 試劑

蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、硫酸鎂、氯化銨、硫酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鈉和氯化鈣等，均為分析純試劑。

1.1.4 儀器設(shè)備

搖床、天平、高壓蒸氣滅菌鍋、無菌操作臺、pH計及紫外-可見分光光度計等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)的方法

1.2.1.1菌種的活化

將已保存的菌種轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃靜止培養(yǎng)24 h后待用。

1.2.1.2種子液制備

挑取活化的菌株單菌落于含50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，160 rpm·min-1，37 ℃搖床振蕩16～18 h后待用。

1.2.1.3搖瓶的培養(yǎng)

分別取一定量的種子液，按2%的比例接入含30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，然后置于37 ℃的搖床中，振蕩培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)速為200 rpm·min-1，以進行單因素發(fā)酵條件研究。

1.2.2 培養(yǎng)基配方的單因素篩選試驗

1.2.2.1碳源

分別用5 g·L-1的葡萄糖、酵母粉、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、麩皮、麩皮∶酵母粉（1∶4）、麩皮∶酵母粉（2∶3）、麩皮∶酵母粉（3∶2）、麩皮∶酵母粉（4∶1）替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源。利用搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)條件，24 h后測定發(fā)酵液的活菌數(shù)，以確定最佳的碳源。

1.2.2.2氮源

分別用10 g·L-1的蛋白胨、硫酸銨、牛肉膏、尿素、硝酸銨、氯化銨、豆粉代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。利用搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)條件，24 h后測定發(fā)酵液的活菌數(shù)，以確定最佳的氮源。

1.2.2.3無機鹽

分別以5 g·L-1麩皮∶酵母粉（3∶2）和10 g·L-1蛋白胨為碳源和氮源，在此基礎(chǔ)上分別加入10 g·L-1的NaCl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KCl替代等

量的基礎(chǔ)發(fā)酵液的無機鹽。采用搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)條件，24 h后測定發(fā)酵液的活菌數(shù)以確定最佳的無機鹽。

每個處理三次重復(fù)，其他發(fā)酵條件與測定方法同“1.2.1.3”。

1.2.3 發(fā)酵條件的篩選

利用篩選出的最適培養(yǎng)基配方，固定搖瓶培養(yǎng)的其他發(fā)酵條件，分別對初始pH、裝液量、溫度、接種量、發(fā)酵時間與轉(zhuǎn)速進行優(yōu)化，如表1所示。

以上試驗均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4 測定方法

菌體生長曲線的測定采用OD600 nm值（下同）比濁法。取發(fā)酵液10～15 mL在2 000 rpm·min-1下離心2 min，測定菌液的OD600 nm值;pH測定儀測定菌液pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源

用不同碳源進行篩選試驗，其他組分都相同進行發(fā)酵。用比濁法測定其發(fā)酵液的OD600 nm值可知，酵母提取物作為碳源時枯草芽孢桿菌的生長明顯優(yōu)于其他碳源，其次是麩皮，如圖1所示。

考慮到以后工業(yè)發(fā)酵的成本，本研究又將麩皮與酵母提取物按1∶4、2∶3、3∶2、4∶1的比例分別作為碳源進行試驗，結(jié)果表明，麩皮與酵母提取物按不同比例混合作為碳源時仍能滿足生產(chǎn)需要，如圖2所示。麩皮∶酵母粉（3∶2）為枯草芽孢桿菌生長的最佳碳源。

2.1.2 氮源

選用7種不同的氮源培養(yǎng)基，從試驗結(jié)果可以看出，以蛋白胨為唯一氮源時該菌的生長能力最強，其發(fā)酵菌液OD600 nm值最高，其次是牛肉膏，如圖3所示，說明枯草芽孢桿菌生長的最適氮源是蛋白胨。

2.1.3 無機鹽

2.2 發(fā)酵條件實驗

2.2.1 初始pH

將初始pH分別調(diào)至不同的pH值，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h。如圖5所示，初始pH值為6.0時發(fā)酵液的OD600 nm值最大，當(dāng)發(fā)酵液的初始pH>6.0時，發(fā)酵液OD600 nm值開始逐漸下降。所以，枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵的最適初始pH值為6.0左右。

2.2.2 接種量

對不同接種量進行篩選，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，設(shè)初始pH值為6.0。通過實驗可知，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)的最適接種量為4%，在接種量為1%～4%時，隨接種量增加，發(fā)酵液的OD600 nm值略有升高。接種量大于4%時，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液OD600 nm值開始下降

2.2.3 裝液量

在搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，設(shè)初始pH值為6.0，接種量為4%。由圖7可知，通過對發(fā)酵液OD600 nm值的測定，采用100 mL裝液量時發(fā)酵液OD600 nm值最大，隨后隨裝液量的增大，發(fā)酵液OD600 nm值呈下降趨勢。

2.2.4 時間

在上述篩選出的最佳發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，分別對不同的發(fā)酵時間進行篩選。通過試驗可知，隨著搖菌時間的增加，其OD600 nm值也增加，在24 h時，其OD600 nm值達到最大，隨著搖菌時間的延長，自24 h后菌液含菌數(shù)開始逐漸減少，OD600 nm值緩慢變小，枯草芽孢桿菌進入生長衰亡期，如圖8所示。所以，最佳的搖菌時間為24 h。

2.2.5 溫度

在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的OD600 nm值。由圖9可知，高溫與低溫都對菌體生長不利。當(dāng)發(fā)酵溫度是37 ℃時，其菌體生長量達到最高。溫度高于或低于37 ℃，含菌數(shù)都有所下降。因此，該菌株的最適發(fā)酵溫度是37 ℃。

2.2.6 轉(zhuǎn)速

如圖10所示，在轉(zhuǎn)速100～250 rpm·min-1條件下培養(yǎng)，在200 rpm·min-1時OD600 nm值最大，枯草芽孢桿菌的生長量最大，因此確定枯草芽孢桿菌最適發(fā)酵轉(zhuǎn)速為200 rpm·min-1。

3 結(jié)論

通過搖瓶單因素試驗，確定了枯草芽孢桿菌的最佳碳源是5 g·L-1麩皮∶酵母粉（3∶2），最佳氮源是10 g·L-1蛋白胨，選用NaCl作為該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽。發(fā)酵最佳條件是發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH值為是6.0，接種量為4%，轉(zhuǎn)速為200 rpm·min-1?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵相關(guān)參數(shù)的研究為下一步其產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了良好的基礎(chǔ)。

（責(zé)任編輯：劉昀）