黃秋良 袁宗勝 蔣天雨

摘要 以芳樟195#一年生扦插苗為研究對象，通過二次正交回旋組合設(shè)計試驗研究接種固氮菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌對芳樟枝精油主成分的影響。結(jié)果表明，試驗組芳樟枝精油主成分芳樟醇含量顯著提高，樟腦、1，8-桉葉油素含量顯著降低;試驗組14（固氮菌=40×108 CFU/盆、巨大芽孢桿菌=40×108 CFU/盆、膠凍樣芽孢桿菌=60×108 CFU/盆、枯草芽孢桿菌=40×108 CFU/盆）的芳樟枝精油主成分芳樟醇含量最高（87.09%），高出對照組7.80%。

關(guān)鍵詞 芳樟;芳樟醇;微生物菌劑;二次正交回旋組合設(shè)計

中圖分類號 S725.5 ?文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）05-0123-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.033

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract Based on annual Cinnamomum camphora （L.） Presl 195 code cuttings，the effects of inoculation of ?Azotobacter chroococum，Bacillus magaterium，Bacillus mucilaginosus and Bacillus subtilis on the branch essential oil of C. camphora leaves were studied by quadratic orthogonal rotating combination method.The result showed the test group significantly increased the content of linalool，the main component of C. camphora branch oil，and decreased the content of camphor and 1，8-eucalyptus oil.The principal component of aromatic camphor essential oil in test group 14 （Azotobacter chroococum=40×108 CFU/pot，Bacillus mucilaginosus=40×108 CFU/pot，Bacillus magaterium=60×108 CFU/pot，Bacillus subtilis=40×108 CFU/pot）had the highest content of linalool （87.09%），which was 7.80% higher than that in the control group.

Key words Cinnamomum camphora（L.）Presl;Linalool;Microbial agent;Quadratic orthogonal gyrocombination design

芳樟[Cinnamomum camphora（L.） Presl]系樟樹的一個生化變種，其含有豐富的芳樟醇（C10H18O），故稱為芳樟[1]。芳樟除了可作用材和綠化用途外，其主要是用于提煉芳樟油。開發(fā)芳樟生物量大、精油含油量高、芳樟醇純度高、樟腦含量低的種質(zhì)是發(fā)展芳香樟油料林產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

微生物菌是對植物生長發(fā)育有益的一類生物菌劑。菌劑中的微生物通過分泌代謝物質(zhì)可直接或間接影響宿主植物的代謝途徑，從而影響宿主的生理特性和生長發(fā)育[2]。例如固氮菌（Azotobacter chroococum）可將空氣中的氣態(tài)氮轉(zhuǎn)化成可直接被植物利用的氨態(tài)氮[3];膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）有解鉀、解磷、固氮等多種作用，并能提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)[4];巨大芽孢桿菌（Bacillus magaterium）是一種植物根系促生細菌，可降解土壤中不能被植物利用的磷和鉀[5-6];枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）既能抑制植物病原菌，又能促進植物生長[7-8]。

芳樟的精油形成、積累和轉(zhuǎn)化過程非常復(fù)雜，受到遺傳和環(huán)境因素的綜合影響[9-11]，通過栽培方式可以影響芳樟的精油合成[12]。目前，鮮有關(guān)于微生物菌劑對芳樟枝精油主成分影響的研究報道。筆者擬通過4因素5水平二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計，研究固氮菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在不同水平條件下對芳樟枝精油主成分的影響，以確定微生物菌劑最佳方案，為開發(fā)與應(yīng)用這些有益微生物和提升芳樟產(chǎn)業(yè)化提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于福建農(nóng)林大學(xué)南門妙峰山苗圃地大棚，試驗苗圃所處區(qū)域位于118°08′～120°31′E， 25°15′～26°29′N，屬亞熱帶海洋氣候，氣候溫和，雨量充沛。

1.2 材料來源

盆栽試驗采用的材料為來源于福建省永安林業(yè)（集團）股份有限公司種苗中心苗圃長勢均勻的芳樟195#一年生扦插苗，平均苗高為21 cm。單一成分微生物菌劑固氮菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌來源于滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所。

1.3 試驗設(shè)計

芳樟盆栽試驗采用4因素5水平二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計（表1）， 試驗組23個措施組合處理（T1～T23）和1個空白對照組（表2），每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)10個盆栽。黃心土和有機質(zhì)采用0.6%高錳酸鉀均勻噴施，后用塑料薄膜覆蓋密封曝曬8 d后再用于試驗苗栽培和接種。盆缽規(guī)格為38.5 cm×30.0 cm×30.0 cm，每盆統(tǒng)一裝消毒后的黃心土5.5 kg。

1.4 方法

1.4.1 接種方法和試驗苗管護 。

芳樟菌劑接種采用灌根接種法，按照試驗設(shè)計方案分別用無菌注射器提取和接種（灌根）到對應(yīng)的芳樟盆栽基質(zhì)中。試驗苗于10月栽植，翌年6月結(jié)束，一共8個月。每周澆水和拔草1～2次，保證試驗苗的正常生長條件。

1.4.2 芳樟精油測定。盆栽試驗8個月后，采摘試驗組芳樟苗枝條，當(dāng)天將各個試驗組枝條擦凈，稱其鮮重，并將數(shù)據(jù)整理保存。將稱量后的同個試驗組的全部樣本枝條進行混合，混合后再將各個試驗組的芳樟枝條分別裝入分裝袋，保存于冰箱用于精油提煉。提取芳樟枝精油采用常壓水蒸汽蒸餾法。將剪碎的100 g枝條裝進蒸餾瓶中，加200 mL開水，蒸餾90 min后熄火，收集精油，測定枝精油含油量，每個試驗組進行3次重復(fù)。

1.4.3 芳樟精油主成分測定。采用SP-6890型氣相色譜儀測定芳樟精油的化學(xué)組成，參照萬琴等[13]的測定方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

采用DPS7.05數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件，對試驗組的芳樟枝精油主成分芳樟醇進行回歸方程的擬合、建立數(shù)學(xué)模型，并進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌劑對芳樟精油主成分分析

對照組芳樟枝精油主成分芳樟醇為80.79%，試驗組平均值為83.43%，比對照組高3.27%;試驗組的樟腦含量平均值為0.03%，對照組樟腦含量為0.19%，比試驗組高出533.33%;試驗組的1，8-桉葉油素含量平均值為0.55%，對照組1，8-桉葉油素含量為0.89%，比試驗組高出61.81%。結(jié)果表明，試驗組大部分芳樟醇含量高于對照組，樟腦含量和1，8-桉葉油素含量低于對照組。

2.2 微生物菌劑與芳樟枝精油主成分芳樟醇回歸方程的建立及顯著性檢驗

對芳樟枝精油主成分芳樟醇進行數(shù)學(xué)模型分析，首先建立編碼方程，然后對編碼方程進行求解。由表3可知，在α=0.05顯著水平下，通過芳樟枝精油主成分芳樟醇的回歸顯著性檢驗得F=8.023 42*，表明微生物菌劑對芳樟枝精油主成分芳樟醇的影響存在顯著回歸關(guān)系，模型成立。

在0.05顯著水平剔除不顯著項后，得到四元二次正交旋轉(zhuǎn)回歸方程為：

Y=83.730 96+0.766 08X1+1.345 70X2+1.481 53X3-0.988 75X1X2-1.043 75X1X4（1）

式中，Y代表枝精油主成分芳樟醇（%）;X1為固氮菌施用量;X2為巨大芽孢桿菌施用量;X3為膠凍樣芽孢桿菌施用量;X4為枯草芽孢桿菌施用量。

2.3 芳樟枝精油主成分芳樟醇單因子效應(yīng)分析

由圖1可知，固氮菌、膠凍樣芽孢桿菌與芳樟的枝精油主成分芳樟醇含量呈直線相關(guān)，表明增施固氮菌、膠凍樣芽孢桿菌可以提高芳樟的枝精油主成分芳樟醇含量。巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌與芳樟的枝精油主成分芳樟醇含量呈近似直線相關(guān)，增施巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌可提高枝精油主成分芳樟醇含量，當(dāng)巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌施用量在編碼值為1.682時，枝精油主成分芳樟醇含量達到最大值，分別是84.93%和84.16%，但在編碼值為1.000～1.682區(qū)間，枝精油主成分芳樟醇含量趨于平緩，表明適當(dāng)增施巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌可以提高芳樟的枝精油主成分芳樟醇含量。

2.4 芳樟枝精油主成分芳樟醇含量最優(yōu)值

運用Excel軟件對各個回歸方程進行最優(yōu)求解，求得的芳樟枝精油主成分芳樟醇含量最優(yōu)值可達92.95%，與之對應(yīng)微生物菌劑施用量分別為固氮菌=20×10.8 CFU/盆、巨大芽孢桿菌=60×10.8 CFU/盆、膠凍樣芽孢桿菌=60×10.8 CFU/盆、枯草芽孢桿菌=60×10.8 CFU/盆，試驗組14（固氮菌=40×10.8 CFU/盆、巨大芽孢桿菌=40×10.8 CFU/盆、膠凍樣芽孢桿菌=60×10.8 CFU/盆、枯草芽孢桿菌=40×10.8 CFU/盆）的芳樟枝精油主成分芳樟醇含量最高（87.09%），最接近于求得的最優(yōu)方案的微生物菌劑施用量。

3 結(jié)論

試驗組芳樟枝精油主成分芳樟醇平均含量高出對照組3.27%;對照組的芳樟枝精油主成分樟腦平均含量高出試驗組533.33%;對照組的芳樟枝精油主成分1，8-桉葉油素平均含量高出試驗組61.81%，結(jié)果表明不同菌劑組合不僅可以提高芳樟醇含量，而且可以降低樟腦含量和1，8-桉葉油素含量，這與筆者研究芳樟優(yōu)良無性系葉精油主成分遺傳穩(wěn)定性分析得到樟腦與芳樟醇合成方向相反的結(jié)論相同[14]。

芳樟是以提取芳樟精油的芳樟醇成分為經(jīng)營目的，精油中的芳樟醇含量高低直接影響精油的價格高低，所以提升芳樟醇含量、降低樟腦和1，8-桉葉油素含量對芳樟產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。在芳樟精油生產(chǎn)過程中，絕大多數(shù)基地均是枝條和葉片混合一起蒸餾出精油，所以提高芳樟枝條精油主成分芳樟醇相對含量是提高芳樟精油品質(zhì)的關(guān)鍵。

試驗組14（固氮菌=40×10.8 CFU/盆、巨大芽孢桿菌=40×10.8 CFU/盆、膠凍樣芽孢桿菌=60×10.8 CFU/盆、枯草芽孢桿菌=40×10.8 CFU/盆）的芳樟枝精油主成分芳樟醇含量最高（87.09%），最接近于求得的最優(yōu)方案的微生物菌劑施用量。表明4種微生物菌劑（固氮菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌）對芳樟葉精油主成分芳樟醇作用效果較好，為生產(chǎn)芳樟專用菌劑提供了理論指導(dǎo)，對芳樟精油化工提純節(jié)約成本和提高芳樟精油品質(zhì)具有重要意義。

參考文獻

[1]江燕.芳樟醇型樟葉精油中主要成分變化規(guī)律的研究[J].香料香精化妝品，2018（6）：1-3.

[2]戴文君.微生物菌劑對望天樹苗木生長及肥力效應(yīng)的影響[D].南寧：廣西大學(xué)，2018：3-4.

[3]梁闐，何為中，譚宏偉，等.不同施氮水平下固氮菌肥對甘蔗的應(yīng)用效果試驗[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，39（5）：11-16.

[4]李馨園，王守義，王淑榮，等.根瘤菌配施膠質(zhì)類芽孢桿菌對大豆葉綠素?zé)晒馓匦浴a(chǎn)量及品質(zhì)的影響[J].大豆科學(xué)，2014，33（4）：541-544，549.

[5]王金玲，劉曉平，趙鳳艷，等.解磷巨大芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2013，29（15）：68-72.

[6]江麗華，王梅，張文君，等.固氮、解磷、解鉀混合菌株協(xié)同固定化技術(shù)[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（12）：18-21.

[7]孫中華，趙鉑錘，陳仕紅，等.枯草芽孢桿菌B67對黃瓜幼苗生長發(fā)育的影響[J].中國瓜菜，2017（2）：15-18.

[8]李瑞芳，田泱源，張慧茹，等.枯草芽孢桿菌BS501a代謝物生防效果與理化特性研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，45（6）：678-683.

[9]RIOSESTEPA R，LANGE I，LEE J M，et al.Mathematical modelingguided evaluation of biochemical，developmental，environmental，and genotypie determinants of essential oil composition and yield in peppermint leaves[J].Plant physiology，2010，152（4）：2105-2119.

[10]GANJEWALA D，LUTHRAR.Essential oil biosynthesis and regulation in the genus Cymbopogon[J].Natural product communications，2010，5（1）：163-172.

[11]DAVIET L，SCHALK M. Biotechnology in plant essential oil production：Progress and perspective in metabolic engineering of the terpene pathway[J].Flavour and fragrance journal，2010，25（3）：123-127.

[12]陳曉明，韋璐陽，劉海龍，等.配方施肥對芳樟枝葉產(chǎn)量和含油率的影響研究[J].西部林業(yè)科學(xué)，2012，41（5）：68-72.

[13]萬琴，蕭偉，王振中，等.氣相色譜法測定金銀花中芳樟醇的含量[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，26（4）：317-318.

[14]黃秋良，張國防，張春，等.芳樟優(yōu)良無性系葉精油主成分遺傳穩(wěn)定性分析[J].福建林業(yè)科技，2016，43（1）：39-42.