羅穎 羅葉強(qiáng) 向光盛

【摘要】目的：葉酸介導(dǎo)VEGF對糖尿病腎病大鼠足微循環(huán)影響研究。方法：將25只健康雄性sd大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為2組，分別為正常組（ 5只）和造模組（ 20只）。給模型組大鼠每天喂高脂高糖日糧，正常組喂基礎(chǔ)日糧。4周之后稱量體重，給予造模大鼠空腹腹腔注射1%的鏈脲佐菌素溶液（STZ，30mg / kg），正常組注射相等容量的檸檬酸鹽緩沖液。在喂養(yǎng)2周過后，測定正常組與模型組的血糖和胰島素水平。用基礎(chǔ)飼料繼續(xù)喂養(yǎng)造模后的大鼠和正常組大鼠。模型大鼠隨機(jī)分為stz組、和低劑量（1.5mg/kg）、中劑量（3.5mg/kg）、高劑量（5.5mg/kg）葉酸組進(jìn)行干預(yù)，再檢測大鼠鼠尾血糖濃度。各組均在干預(yù)灌胃3d后在心臟處取血制備血清。將完全培養(yǎng)基底加入到面積 75 cm2的培養(yǎng)瓶中行小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)。將正常組和模型組小鼠足細(xì)胞的培養(yǎng)依次分為空白對照組、stz組、正常鼠血清對照組和添加低、中、高劑量葉酸血清組共六組。刺激24 h之后用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測大鼠血清VEGF水平，PCR技術(shù)檢測mRNA中VEGF水平，后用蛋白質(zhì)印跡法（W B）檢測蛋白質(zhì)VEGF表達(dá)水平。結(jié)果：VEGF的陽性表達(dá)可以在高糖組和正常鼠血清組小鼠足細(xì)胞觀察到。添加葉酸的血清組足細(xì)胞VEGF在蛋白質(zhì)和mRNA中的表達(dá)比高糖組和正常鼠血清組中的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：葉酸能夠介導(dǎo)血管內(nèi)皮因子（VEGF）水平從而改善糖尿病腎病大鼠足的微循環(huán)。

【關(guān)鍵詞】葉酸 糖尿病腎病 足細(xì)胞 血管生長內(nèi)皮因子

一、材料

（一）動(dòng)物

健康雄性SD大鼠25只，體重200～220g。

（二）藥物

葉酸片購于天津力生葉酸片。分別配置低（1.5mg/kg）、中（3.5mg/kg）、高劑量（5.5mg/kg）葉酸。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）分組與細(xì)胞培養(yǎng)

將25只健康雄性SD大鼠在基礎(chǔ)喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為2組，分別是正常組（5只）和造模組（20只）。模型組大鼠喂每日喂養(yǎng)高脂高糖飼料。正常組喂以基礎(chǔ)飼料。4周后，稱重。造模大鼠空腹腹腔注射1%的鏈脲佐菌素溶液（STZ，30mg/kg），正常組注射相同體積檸檬酸鹽緩沖液。在喂養(yǎng)2周后測量血糖和胰島素水平，模型組大鼠和正常組大鼠繼續(xù)喂食基礎(chǔ)飼料。隨后將成模大鼠隨機(jī)分為正常對照組、1%鏈脲佐菌素溶液組（30mg/kg）和低（1.5mg/kg）、中（3.5mg/kg）、高劑量（5.5mg/kg）葉酸并注射1%鏈脲佐菌素溶液組（30mg/kg）組進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)后檢測鼠尾血糖濃度。在灌胃3天后心臟取血制備血清。小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)：將完全培養(yǎng)基加入到底面積為75cm2的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

（二）指標(biāo)檢測

（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）? 運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法檢測血管內(nèi)皮因子VEGF在大鼠血清中的濃度。通過計(jì)算確定實(shí)驗(yàn)所需的板條數(shù)量，并將其取出后再放置于框架中。設(shè)置空白孔并僅添加TMB顯色液和終止液在空白孔中。對每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)測試，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)孔中，并在室溫下溫育120分鐘。將板洗滌5次并加入生物素化的抗體工作溶液。在室溫下孵育60分鐘。將板洗滌5次，加入酶結(jié)合物工作溶液，在室溫下進(jìn)行避光孵育20分鐘。將板洗滌5次，再加入顯色劑TMB100ul/孔，黑暗中溫室孵育20分鐘，加入50ul/孔的終止液，混合均勻后立刻測量OD450的值。

（2）熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù) 用于檢測mRNA中VEGF水平。首先提取細(xì)胞中總RNA并在培養(yǎng)瓶中加入1mlTrizol，在15分鐘后將細(xì)胞收集到Ep管中，將每只管中加入200μL的三氯甲烷混勻后4℃12000rpm/min中離心20分鐘。將取得的上層水相移到新的EP管后，將等量的異丙醇混勻后加入其中再冰上靜置15分鐘。于4℃12000rpm/min離心20分鐘后，棄去上清液并干燥。用75%的無水乙醇lml充分沖洗RNA沉淀后再次進(jìn)行離心，棄去上清液后于室溫干燥。用適量1%的DEPC水來溶解RNA，后用槍輕輕吹打?qū)⑵浠靹?，品質(zhì)鑒定RNA樣品。混勻PCR混合物并將其室溫孵育1h。95℃預(yù)變性10分鐘，95℃變秒10秒，60℃退火20秒， 72℃延伸15秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后記錄CT值。將GAPDH作為內(nèi)參，采用2—△△ct方法分析，對照組為1，計(jì)算其余各組相對表達(dá)量的情況。

（3）免疫印跡法 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）分析蛋白質(zhì)中VEGF的表達(dá)水平

（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測量數(shù)據(jù)中計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計(jì)方法使用單因素方差分析和 LSD 檢驗(yàn)。

三、結(jié)果

（一）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測大鼠血清VEGF水平

顯微鏡下結(jié)果顯示VEGF在大鼠足細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)。正常組和高糖組的細(xì)胞漿與核周均可見陽性表達(dá)且表達(dá)量接近。然而，添加了低、中、高劑量的葉酸組中VEGF的表達(dá)較低。

（二）熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測mRNA中VEGF水平

添加葉酸組中VEGF在mRNA中的表達(dá)水平較高糖組和正常鼠血清組明顯降低，（p<0.05）并且葉酸劑量與VEGF表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。葉酸的劑量越高，VEGF在mRNA中的表達(dá)水平就越低。

（三）蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測蛋白質(zhì)VEGF表達(dá)水平

由結(jié)果可知與正常大鼠血清組VEGF的表達(dá)情況明顯升高。添加不同劑量葉酸之后各組大鼠VEGFmRNA表達(dá)量均降低。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P<0.05）。

四、討論

VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）是與血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜上的特定受體結(jié)合來引發(fā)下游信號級聯(lián)并促進(jìn)血管新生的促血管生成因子。大量研究表明，它對血管內(nèi)皮細(xì)胞在骨、肺、腎臟、腦、腫瘤等全身各組織器官的增殖、遷移和趨化具有顯著的促進(jìn)作用。Magdalena Tuszyńska詳細(xì)闡述了葉酸在人體中的發(fā)生和營養(yǎng)作用。葉酸是一種水溶性維生素，在基因調(diào)控所需的甲基化過程中起著甲基供體的重要作用。葉酸也參與核糖核酸和脫氧核糖核酸的合成。Sonny Bherwani等人通過測量糖尿病腎病患者血清葉酸與尿微量白蛋白比值發(fā)現(xiàn)葉酸水平的下降與糖尿病腎病有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病腎病小鼠的足細(xì)胞VEGF表達(dá)較對照小鼠高，顯示其在DN 微血管病變中的意義重大。我們在飼料中添加不同劑量的葉酸，結(jié)果顯示添加葉酸的血清組小鼠足細(xì)胞VEGF在蛋白質(zhì)和mRNA中的表達(dá)均較高糖組和正常鼠血清組降低且葉酸劑量與VEGF的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。由此說明補(bǔ)充葉酸能夠介導(dǎo)血管內(nèi)皮因子（VEGF）水平從而改善糖尿病腎病大鼠足的微循環(huán)。

基金項(xiàng)目：項(xiàng)目編號：長醫(yī)教[2018]77號-210。