張愛君，程鵬高，唐 娜*，曹軍瑞

(1.天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津 300457；2.自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192；3.天津市鹵水化工與資源生態(tài)化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，對能源特別是石油的需求量日益增長，但石油在開采、煉制、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程中發(fā)生的海上溢油事故時(shí)有發(fā)生，加劇著石油對海洋環(huán)境的威脅[1-2]。目前常用的治理海上溢油污染的方法主要有物理方法、化學(xué)方法和生物方法三種方法。與物理化學(xué)修復(fù)手段相比，生物修復(fù)具有成本低、無二次污染、處理效果好等優(yōu)點(diǎn)，在諸多含油海水處理方法中被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的處理技術(shù)[3]，并已有生物修復(fù)法治理石油污染的實(shí)例[4]。目前，已報(bào)道的石油降解菌有數(shù)百種，涉及數(shù)十個(gè)屬[5]，如芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、脫硫菌(Desulfosarcina)、紅球菌(Rhodococcus)等[6-9]。由于海水較高的鹽度制約著石油降解菌的生長及降解效率，傳統(tǒng)的非耐鹽菌株并不適合對高鹽環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)。因此，海洋來源的耐鹽石油降解菌在海上溢油處理中具有更好的應(yīng)用前景[10]。

本課題組在前期的研究中，從渤海入?？诘哪嗌持蟹蛛x獲得一株可降解石油的菌株SI-JHS，鑒定為假交替單胞菌(Pseudoalteromonsp.)，能夠以石油為唯一碳源。本研究以SI-JHS為出發(fā)株，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面分析法[11]對石油降解菌SI-JHS降解石油的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，確定培養(yǎng)基主要影響因子及其最佳添加量，為海洋溢油的生物降解提供前期技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

海洋石油降解菌SI-JHS(Pseudoalteromon sp.)為本實(shí)驗(yàn)室保存，篩選自渤海入海口處的修船廠灘涂。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 值7.0，固體培養(yǎng)基添加1.5%～2%瓊脂粉。該培養(yǎng)基用于菌株的保存和傳代培養(yǎng)。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 35.0 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NH4NO31.0 g，酵母提取物 0.01 g，蒸餾水補(bǔ)足1 L，pH值7.5。121 ℃，高壓滅菌20 min。石油含量1 g·L-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

1.3.1 菌株的活化

將保存的海洋石油降解菌SI-JHS轉(zhuǎn)接于LB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2 d。挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min搖床培養(yǎng)過夜，按1%接種量將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行條件摸索試驗(yàn)。

1.3.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

采用Design expert 軟件，選擇石油降解菌SI-JHS培養(yǎng)基中的5個(gè)因子，進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察石油降解率。實(shí)驗(yàn)各因素的水平設(shè)置見表1。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素編碼及水平

1.3.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著影響因子的正負(fù)效應(yīng)，設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)路徑和步長，使生物表面活性劑產(chǎn)量逼近最佳值反應(yīng)區(qū)域[12]。

1.3.4 響應(yīng)面分析

利用Design-Expert8.06軟件進(jìn)行2因子3水平Central Composite Design的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定顯著因子的最佳水平。

1.3.5 石油降解率測定

采用紫外分光光度法繪制石油含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。試管中加入50 μL硫酸溶液進(jìn)行酸化，加1 mL正己烷萃取，萃取液轉(zhuǎn)移至25 mL離心管， 160 r/min震蕩 2 min，10000 r/min離心3 min，測定其上層液體于波長227 nm處的吸光度(以A1表示)。同時(shí)以未加菌株的篩選培養(yǎng)基為空白對照，測定其上層液體于波長227 nm處的吸光度(A0)，將吸光度帶入石油標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算石油含量(C0為空白對照石油油含量，C1為降解后殘余石油含量)。降解活性以降解率表示：

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

采用初始發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)海洋石油降解菌SI-JHS時(shí)，石油降解率可達(dá)到70%。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化培養(yǎng)基組分。以發(fā)酵培養(yǎng)基5種成分作為5各因素，選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)為N=12的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，X1、X3、X5、X7、X9分別代表磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硝酸銨、酵母提取物，設(shè)計(jì)X2、X4、X6、X8、X10空白作為誤差分析項(xiàng)。每個(gè)因素分別選取了高水平(+1)和低水平(-1)，以石油降解率作為響應(yīng)值。PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值見表2，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)兩個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值

利用Design-expert8.06軟件對PB試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由石油降解率影響因素主效應(yīng)分析結(jié)果見表3。

表3 石油降解率影響因素主效應(yīng)分析結(jié)果

由表3可以看到，回歸模型的P值為0.0053(P<0.05)，說明該模型顯著，在整個(gè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)區(qū)間內(nèi)擬合較好。各變量對響應(yīng)值影響顯著性油F值檢驗(yàn)來判定，P值越小，響應(yīng)變量的顯著程度越高。培養(yǎng)基中各因素對石油降解率影響效應(yīng)大小順序依次為：硝酸銨>硫酸鎂>磷酸氫二鉀>磷酸二氫鉀>酵母提取物，其中硝酸銨(P=0.0005)、硫酸鎂(P=0.0201)是主要的影響因子(P<0.05)，其他因素對發(fā)酵液表面張力變化影響不顯著。因此，選擇硝酸銨和硫酸鎂這兩個(gè)因素進(jìn)行更深入的研究。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

分析Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定硝酸銨和硫酸鎂為主要的影響因素，硫酸鎂對石油降解率起負(fù)效應(yīng)，即硫酸鎂濃度越高，石油降解率越小。硝酸銨對石油降解率影響為正效應(yīng)，提高硝酸銨的含量，可以提高石油降解率。根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定兩個(gè)影響因子的實(shí)驗(yàn)范圍和爬坡步長，設(shè)計(jì)最陡爬坡路徑(表4)。

通過表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，石油降解率變化趨勢為先升高再下降，在第8組實(shí)驗(yàn)中石油降解率最大，因此選擇第8組實(shí)驗(yàn)的各因素作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)，即硫酸鎂0.75 g/L，硝酸銨2.0 g/L。

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對2個(gè)影響顯著的因子硫酸鎂和硝酸銨進(jìn)行中心組和設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析，以確定他們的最佳值，獲得最佳石油降解效果。實(shí)驗(yàn)因子水平及編碼見表5，共計(jì)13組實(shí)驗(yàn)，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀、酵母提取物濃度分別為1 g/L，1 g/L，0.01 g/L。

表5 中心組和設(shè)計(jì)及結(jié)果

以石油降解率為響應(yīng)值，Design of experiments8.06軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果如表6所示。

表6 方差分析

對中心組和設(shè)計(jì)確定的各參數(shù)取值范圍進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果如圖1所示。

圖中顯示硫酸鎂和硝酸銨對石油降解率的交互影響的三圍曲面圖和相應(yīng)等高線圖，回歸模型的最佳值存在響應(yīng)面最低點(diǎn)，等高圖的圓心。通過Design of experiments8.06軟件計(jì)算，得出發(fā)酵液表面張力最低時(shí)培養(yǎng)基成分為：氯化鈉35 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.89 g/L，硝酸銨2.11 g/L，酵母提取物0.01 g/L，在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液的對石油降解率達(dá)到80.5%。

圖1 硫酸鎂和硝酸銨交互影響的三維曲面圖和相應(yīng)等高線圖

2.4 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

為了驗(yàn)證理論值與實(shí)驗(yàn)值的符合性，按照優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基配方對菌株SI-JHS發(fā)酵液對降解效果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)測得平均降解率為80.8%，與預(yù)測值基本符合，證實(shí)了模型的有效性。

3 結(jié)論

海洋來源的石油降解菌在海上溢油的生態(tài)修復(fù)技術(shù)方面具有良好的應(yīng)用前景。本研究利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)對菌株SI-JHS降解石油的培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，硝酸銨和硫酸鎂為顯著影響因子，通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和中心組和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，建立硝酸銨和硫酸鎂的二次回歸方程，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明了該模型可靠性，最終獲得海洋石油降解菌SI-JHS降解石油的最佳培養(yǎng)基配方為：氯化鈉35 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.89 g/L，硝酸銨2.11 g/L，酵母提取物0.01 g/L。使用優(yōu)化條件培養(yǎng)海洋石油降解菌SI-JHS，石油降解率為80.8%，與預(yù)測值接近，比優(yōu)化前提高了14.2%。