王亞琪，曾普華，郜文輝△

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)(長沙 410208)；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤中心(長沙 410006)

原發(fā)性肝癌具有起病隱匿、惡性程度高、疾病進(jìn)展快、預(yù)后較差、死亡率高等特點。我國肝癌發(fā)病率位居全球首位，其發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均占全球半數(shù)以上。目前肝癌以手術(shù)、介入、分子靶向治療為主，存在高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率、治療缺乏針對性、難治性耐藥和源頭創(chuàng)新藥物少等問題[1-2]。

肝癌患者對靶向藥物Sorafenib的快速耐藥是導(dǎo)致臨床分子靶向治療失敗的主要原因之一。目前實驗研究表明[3-5]，Sorafenib抗血管新生可加重局腫瘤微環(huán)境乏氧狀態(tài)，刺激HIF-1α的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境下可能通過變形、遷移，重新粘附，形成血管樣結(jié)構(gòu)，通過血管擬態(tài)(VM)獲取血液供應(yīng)，從而產(chǎn)生耐藥性。目前西醫(yī)對其耐藥問題尚無行之有效的治療方法，而傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有“多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點”的作用[6]，尋求逆轉(zhuǎn)Sorafenib耐藥的方藥可望帶來新突破。故本實驗主要分析HIF-1α及VM的表達(dá)與耐藥的關(guān)系，探討益氣化瘀解毒方聯(lián)合Sorafenib對逆轉(zhuǎn)人肝癌細(xì)胞Sorafenib耐藥的作用及可能機制。

材料與方法

1 材 料 人肝癌QGY7702細(xì)胞和人肝癌QGY7702/Sora細(xì)胞均由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所劉祖龍博士惠贈。實驗動物：BALB/c-nu裸鼠，雄性，4～5周齡，70只，SPF級，購于長沙斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SYXK(湘)2014-0012。索拉非尼(南通飛宇生物科技有限公司，規(guī)格：200 mg，批號：FY34720409)。益氣化瘀解毒方(白參10 g，黃芪30 g，醋莪術(shù)、重樓各15 g，半枝蓮30 g，甘草5 g等)飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。高糖DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液(Hyclone);胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗溶液(Gibco)。Anti-HIF-1α(HIF1A)Antibody(博士德)，Anti-CD31 Rabbit pAb(Sevicebio),通用二步法檢測試劑盒(中杉金橋)。

2 藥物制備 Sorafenib稀釋液配制：索拉非尼200 mg用100 ml生理鹽水充分混勻，稀釋濃度為2 mg/ml，置于4℃?zhèn)溆谩Ｖ兴幍募逯螅喊幢壤渲煤盟幉?，加入適量冷水浸泡30 min，文火煎煮，第一道10倍水煎煮2 h，第二道8倍水煎煮1 h，兩道混合過濾、離心去渣，再將藥物濃縮至含1 g生藥/ml，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 將人肝癌細(xì)胞株QGY7702和耐藥株QGY7702/Sorafenib接種于10% 胎牛血清+90% DMEM+1%青/鏈霉素雙抗溶液的完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿85%左右時用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。耐藥細(xì)胞培養(yǎng)至約合120個T25瓶(每瓶長滿約5×106個細(xì)胞)，非耐藥細(xì)胞約20個T25瓶數(shù)量以上，胰酶消化，2000 r/min,5 min離心，收集細(xì)胞，用PBS緩沖液稀釋細(xì)胞濃度至約1×107個/0.2 ml。

4 動物造模、分組、給藥 將收集的細(xì)胞接種至裸鼠的臀背部皮下，每只接種0.2 ml(約含1×107個細(xì)胞)，接種1周后，65只裸鼠臀背部接種處均形成一黃豆大小隆起。除完全空白對照組親本細(xì)胞模型7只外，其余耐藥模型隨機分為6組，模型組10只，益氣化瘀解毒方組9只，重樓組10只，順鉑組10只，Sorafenib組10只，中西聯(lián)合(益氣化瘀解毒方+Sorafenib)組9只。成瘤后5 d/次監(jiān)測裸鼠的體重變化并記錄。根據(jù)人臨床給藥劑量倍數(shù)換算法折算動物給藥總劑量。益氣化瘀解毒方組裸鼠灌胃總藥量為15 g/kg，1次/d；重樓組裸鼠灌胃總藥量為4.5 g/kg，1次/d；Sorafenib組裸鼠灌胃總藥量為30 mg/kg，1次/d；順鉑組裸鼠腹腔注射總藥量為25 mg/kg，1次/5d；中西聯(lián)合組藥物用中藥和Sorafenib各半灌胃，1次/d；空白組給予生理鹽水灌胃，1次/d。根據(jù)裸鼠體重計算灌胃劑量，連續(xù)用藥21 d后取瘤稱重，部分組織用4%多聚甲醛固定，部分存放于液氮中。

5 免疫組化法檢測瘤組織HIF-1α表達(dá) 瘤組織常規(guī)石蠟包埋，切片。脫蠟后入水，滴加抗原修復(fù)液、正常山羊血清封閉液、一抗、二抗，經(jīng) DAB 顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，水洗，脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。拍照，進(jìn)行圖象分析。HIF-1α表達(dá)的判定：HIF-1α主要表達(dá)在細(xì)胞核，陽性染色為棕黃/褐色顆粒。低倍鏡下(×100)確定5個陽性著色密集區(qū)域，在高倍鏡(×400)視野下拍照，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取5個視野的均值。

6 CD31/PAS雙重染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，按照SP法操作，進(jìn)行CD31免疫組化染色，DBA染色至血管內(nèi)皮細(xì)胞著色后，終止反應(yīng)，過碘酸溶液中氧化，再行PAS染色，最后用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，中性樹膠封片。拍照，進(jìn)行圖象分析。VM表達(dá)的判定：CD31為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子，陽性定位于細(xì)胞膜。PAS 能夠把血管周圍富含糖原的基底膜結(jié)構(gòu)染成紫紅色。內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記的血管為 CD31/PAS 雙陽性，而VM是由腫瘤細(xì)胞圍成的血液流通的管道，基底膜在周圍包圍，CD31 陰性而 PAS 陽性，并且管腔內(nèi)可觀察到紅細(xì)胞。低倍鏡下(×200)確定5個陽性著色密集區(qū)域，在高倍鏡(×400)視野下拍照，計數(shù)血管擬態(tài)，取5個視野的均值。

結(jié) 果

1 各組移植瘤凈重的比較 見表1。從各組瘤凈重比較來看，耐藥細(xì)胞模型組瘤普遍比不耐藥細(xì)胞空白組小，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。益氣化瘀解毒方聯(lián)合Sorafenib組與模型組相比差別，瘤體重量明顯減輕，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組瘤凈重比較(g)

注：與模型組比較，*P<0.05；模型組與空白對照組比較,△P<0.01

2 各組瘤組織中HIF-1α表達(dá)水平 見表2。模型組瘤組織中HIF-1α表達(dá)水平高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；益氣化瘀解毒方組及中西聯(lián)合組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，兩組均可抑制HIF-1α表達(dá)(圖1)。

3 各組瘤組織中VM表達(dá)水平 見表2。Sorafenib組瘤組織中VM表達(dá)水平明顯高于模型組的表達(dá)水平(P<0.05)；中西聯(lián)合組與Sorafenib組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，可抑制VM表達(dá)水平(圖2)。

圖1 各組瘤組織HIF-1α表達(dá)(免疫組化法，×400)

圖2 各組瘤組織VM表達(dá)(CD31/PAS染色，×400)

表2 各組瘤組織HIF-1α及VM表達(dá)水平比較(個/視野)

注：與模型組比較，*P<0.05，△P<0.01；與Sorafenib組比較，

#P<0.05，◇P<0.01

3 HIF-1α與VM表達(dá)水平的相關(guān)性 HIF-1α在瘤組織中的表達(dá)水平為(51.21±7.77)個/視野，VM在瘤組織中的表達(dá)水平為(8.17±1.50)個/視野。兩者之間存在相關(guān)性，呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.609>0.4，可認(rèn)為兩者之間存在中度相關(guān)(圖3)。

圖3 HIF-1α與VM相關(guān)關(guān)系散點圖及相關(guān)系數(shù)

討 論

原發(fā)性肝癌惡性程度高、預(yù)后差，而作為一線治療藥物的分子靶向藥物Sorafenib因臨床快速獲得性耐藥問題導(dǎo)致客觀有效率較差。因此，本實驗主要深入探討益氣化瘀解毒方聯(lián)合Sorafenib對耐藥模型干預(yù)的影響，以明確其作用及作用機制，對于改善肝癌治療及預(yù)后具有重要意義。

肝癌耐藥在中醫(yī)并確切的稱謂，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可屬中醫(yī)“肝積”、“積聚”、“脅痛”、“肝脹”、“黃疸”、“虛勞”等相關(guān)病癥。中醫(yī)古籍對肝癌相關(guān)病癥的病因病機論述眾多。肝癌病情復(fù)雜、惡性程度高、侵襲性強、進(jìn)展快、預(yù)后極差、多伴有肝病背景、多種邪毒和病理因素夾雜等，這些可歸屬于中醫(yī)“毒”或“癌毒”的范疇；肝癌為有形之積，肝腫塊常伴疼痛、舌質(zhì)暗紅或瘀斑是“瘀”的客觀表現(xiàn)；肝癌患者常見腹脹、納差、神疲、乏力伴進(jìn)行性消瘦等為“脾虛”之癥；癌毒、瘀血、脾虛三者始終并存，互為因果，惡性循環(huán)，貫穿于肝癌整個病程?！皥哉哕浿?“衰者補之”，治療當(dāng)攻補兼施，故“益氣化瘀解毒”是切合肝癌病機的常用治法[7-8]。

“益氣化瘀解毒方”是經(jīng)病證結(jié)合、精準(zhǔn)配伍而成的臨床應(yīng)用多年的效驗方。全方以白參、黃芪益氣健脾；莪術(shù)行氣化瘀散結(jié)；重樓、半枝蓮清熱解毒，全方藥物配伍精要，扶正抗癌，標(biāo)本兼治。該組方藥物富含人參皂甙、重樓皂苷、多糖、莪術(shù)醇、姜黃素、糖蛋白等[9-11]多種抗腫瘤活性組分，既往臨床研究證實具有穩(wěn)定瘤體、調(diào)節(jié)免疫、改善生活質(zhì)量、抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而使患者呈現(xiàn)“帶瘤生存”的特點。課題組前期基于對“益氣化瘀解毒方”的“多活性組分配伍、多環(huán)節(jié)、多靶點”抗肝癌作用研究[12-14]，提示該方能抑制人肝癌Hep G2細(xì)胞和裸鼠移植瘤的生長，能下調(diào)HIF-1α、VEGF等表達(dá)，上調(diào)E-cad表達(dá)，抑制肝癌血管新生及血管生成擬態(tài)、EMT的形成，對腫瘤血管微環(huán)境具調(diào)節(jié)作用。

目前多數(shù)研究證實[5]，實體腫瘤普遍存在缺氧的現(xiàn)象，HIF-1α是腫瘤細(xì)胞缺氧調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控中心，在低氧環(huán)境中為腫瘤細(xì)胞提供空間和營養(yǎng)物質(zhì)。HIF-1α是缺氧誘導(dǎo)因子信號調(diào)節(jié)通路的中心環(huán)節(jié),是一種氧分壓感受器,在有氧環(huán)境中受各種酶調(diào)控可被降解;缺氧時,蛋白酶體系不能泛素化使HIF-1α不能被降解而在細(xì)胞體內(nèi)大量蓄積,蓄積的HIF-1α使癌細(xì)胞更適應(yīng)低氧環(huán)境,為癌細(xì)胞的增殖、遷移及耐藥提供有利條件。血管擬態(tài)(VM)[15]是一種不同于經(jīng)典的完全不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成模式，腫瘤細(xì)胞模擬內(nèi)皮血管生成途徑形成網(wǎng)狀管道樣結(jié)構(gòu)，輸送血液的微循環(huán)管道。VM的形成為腫瘤的增殖、遷移和侵襲，甚至耐藥的產(chǎn)生提供良好的營養(yǎng)環(huán)境。同時，科學(xué)實驗已證實[3，5]，缺氧微環(huán)境中HIF-1α的過表達(dá)是調(diào)控VM形成的重要因素。

本實驗結(jié)果提示，HIF-1α與VM的表達(dá)有中度相關(guān)性，呈正相關(guān)。耐藥模型組與不耐藥空白對照組比較，HIF-1α與VM表達(dá)均有高表達(dá)，說明耐藥現(xiàn)象的發(fā)生與機體HIF-1α與VM的過表達(dá)相關(guān)。益氣化瘀解毒方聯(lián)合Sorafenib干預(yù)后，可明顯抑制人肝癌Sorafenib耐藥細(xì)胞裸鼠移植瘤瘤體生長，使瘤組織的HIF-1α與VM表達(dá)明顯下降，說明益氣化瘀解毒方聯(lián)合Sorafeinb在基于抗腫瘤作用上亦可改善腫瘤組織乏氧微環(huán)境狀態(tài)，抑制血管擬態(tài)的形成，提高機體對Sorafenib的敏感性，從而拮抗Sorafenib耐藥的產(chǎn)生。

綜上，益氣化瘀解毒方聯(lián)合Sorafenib基于抗腫瘤作用亦可抑制HIF-1α與VM的表達(dá)，改善瘤組織乏氧微環(huán)境狀態(tài)，拮抗機體Sorafenib耐藥。目前多數(shù)研究亦表明，耐藥的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞間質(zhì)化的轉(zhuǎn)變、腫瘤干細(xì)胞、炎性微環(huán)境、外泌體及基因調(diào)控等方面密切相關(guān)，拮抗耐藥應(yīng)從多角度多層次考慮，對于益氣化瘀解毒方的挖掘亦有待進(jìn)一步深入。