王 矩，陳 瑾，徐馨璐，余 琪，宋明柯

1. 上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)與化學(xué)生物學(xué)系，上海 200025；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2015級臨床醫(yī)學(xué)八年制二大班，上海 200025

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是一種常見的腦重大疾病。其相關(guān)臨床研究[1]顯示，約40%的TBI患者于住院后病情繼續(xù)惡化，即除受傷時刻給患者造成損傷外，TBI發(fā)生后的數(shù)分鐘至數(shù)天可誘發(fā)繼發(fā)性腦損傷，主要包括腦腫脹、腦梗死、遲發(fā)性腦水腫和腦疝。目前，國內(nèi)外有關(guān)繼發(fā)性腦損傷的藥物治療策略尚未獲得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，因此探索并開發(fā)新的TBI治療方法已成為該領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。

格列苯脲（glibenclamide）是臨床上常用的治療2型糖尿病的降糖藥，其藥物靶點(diǎn)是磺酰脲類受體1（sulfonylurea receptor 1，SUR1）。近年來有研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，在缺血或出血性腦卒中的早期階段，磺酰脲類受體1-瞬時受體電位通道M4型（sulfonylurea receptor 1-transient receptor potential melastatin 4，SUR1-TRPM4）通道參與了細(xì)胞毒性腦水腫的發(fā)生及惡化過程，且SUR1-TRPM4通道受SUR1調(diào)節(jié)；而非胰島素依賴型糖尿病藥物格列本脲則可抑制SUR1的活性、阻礙SUR1-TRPM4通道的開放，進(jìn)而減緩腦水腫疾病的進(jìn)程。

研究[2]發(fā)現(xiàn)，TBI誘發(fā)的繼發(fā)性腦損傷與缺血性腦卒中在病理機(jī)制方面存在較多相似之處，即在上述疾病發(fā)生過程中均可誘發(fā)細(xì)胞毒性腦水腫；而該細(xì)胞毒性腦水腫則是由神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的整個神經(jīng)血管單元的通透性發(fā)生病理變化造成。有文獻(xiàn)[4-5]報道，格列本脲經(jīng)皮膚滲透給藥入腦后，可減少TBI造成的組織出血、促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。然而，格列苯脲對由TBI造成的腦水腫和腦損傷是否有減輕作用尚待進(jìn)一步研究。此外在臨床實(shí)踐中，TBI患者早期常伴有昏迷、循環(huán)功能衰竭等癥狀，口服、經(jīng)皮注射和靜脈注射等常規(guī)方法均不易實(shí)現(xiàn)患者的體內(nèi)藥物輸送，繼而考慮鼻腔給藥或?qū)⒛軌驗(yàn)樗幬锏妮斔头绞教峁┬碌乃悸贰?/p>

基于此，本研究擬通過鼻腔給予格列苯脲治療由TBI造成的腦損傷，觀察24 h后格列苯脲對早期細(xì)胞毒性腦水腫的治療作用以及其他神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，以期為臨床上TBI的藥物治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠41只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司），體質(zhì)量20～25 g，動物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2018-0003。小鼠飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)的飼養(yǎng)籠中，使用許可證：SYXK（滬）2008-0050。小鼠飼以60Co輻照殺菌飼料，自由進(jìn)食、飲水。飼養(yǎng)條件如下：溫度為18～29 ℃，空氣相對濕度40%～60%，光周期為12/12，環(huán)境噪聲≤60 dB。小鼠被隨機(jī)分為格列苯脲治療組（n=21）、對照組（n=19）和活體熒光成像組（n=1）。

本研究的動物飼養(yǎng)條件符合相應(yīng)實(shí)驗(yàn)動物等級標(biāo)準(zhǔn)，所有動物相關(guān)操作均按照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的規(guī)定執(zhí)行。

1.2 小鼠右腦半球TBI模型的建立

用3%～4%異氟烷誘導(dǎo)格列苯脲治療組和對照組小鼠麻醉直至尾捏實(shí)驗(yàn)無反應(yīng)，而后再用1%～1.5%異氟醚進(jìn)行麻醉維持。剔除小鼠頭部毛發(fā)，暴露頭皮。取俯臥位將小鼠固定于腦立體定位儀，使其頭頂部盡量呈水平。碘伏消毒頭部皮膚后，用眼科剪在頭頂部正中剪開一個約2.0 cm縱形切口，分離骨膜，暴露前囟、冠狀縫及矢狀縫。將切口右側(cè)皮膚下拉或向內(nèi)輕微折疊，充分暴露手術(shù)視野。以前囟后1.59 mm、中線右側(cè)1.61 mm交匯處為中心點(diǎn)，用微型顱鉆建立直徑為2.5 mm的骨窗。隨后，用尖鑷輕輕挑開骨窗，去除骨片，暴露硬腦膜。調(diào)節(jié)撞擊桿與骨窗前后、左右、上下的距離，直到撞擊桿的撞擊面與骨窗區(qū)域契合，且與骨窗平面垂直。采用控制性腦皮質(zhì)撞擊（controlled cortical impact，CCI）法對小鼠右腦半球進(jìn)行撞擊，撞擊深度為1.5 mm、撞擊時間80 ms/次，形成腦部損傷。撞擊后應(yīng)迅速移開撞擊桿，避免小鼠被二次損傷。經(jīng)充分止血并再次消毒后，用組織膠水粘合頭皮，粘合時避免膠水與損傷部位直接接觸。

1.3 經(jīng)鼻給藥治療及藥物溶液配制

使用移液器向各組小鼠雙側(cè)鼻孔交替并緩慢地滴入不同藥物溶液，實(shí)現(xiàn)經(jīng)鼻給藥治療。3種藥物溶液的配制如下：①2 mg/mL格列苯脲溶液，即將1 mg格列苯脲粉末（HY-15206，美國MCE公司）溶于20.24 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）形成100 mmoL儲備液；吸取10 μL儲備液至237 μL含有8%吐溫 -80的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），充分渦旋后獲得。于格列苯脲組小鼠后續(xù)研究備用。②不含格列苯脲的藥物溶劑，即吸取10 μL DMSO至237 μL含有8%吐溫 -80的PBS，充分渦旋后獲得。于對照組小鼠后續(xù)研究備用。③ 格列苯脲熒光探針溶液，即用Hank's平衡鹽溶液稀釋格列苯脲熒光探針（BODIPY? TR Glibenclamide，40764ES20，上海翊圣生物科技有限公司），稀釋比例為1:5。于活體熒光成像組小鼠后續(xù)研究備用。

1.4 格列苯脲經(jīng)鼻給藥的入腦情況檢測

用3%～4%異氟烷誘導(dǎo)活體熒光成像組小鼠麻醉直至尾捏試驗(yàn)無反應(yīng)，而后再用1%～1.5%異氟醚進(jìn)行維持麻醉，隨后剔除小鼠頭部毛發(fā)并暴露頭皮。給藥前，先用IVIS Spectrum-CT小動物活體成像系統(tǒng)（美國PerkinElmer公司）對小鼠腦部進(jìn)行拍照，記錄未給藥時的腦部熒光成像情況。隨后于避光條件下，經(jīng)小鼠鼻腔滴入格列苯脲熒光探針溶液，讓小鼠自然吸入。于100 min時拍攝小鼠腦部，并由Living Image軟件對腦區(qū)信號的強(qiáng)度進(jìn)行量化，獲得熒光成像情況。熒光探針由紅色熒光染料BODIPY? TR和格列苯脲偶聯(lián)而成，其激發(fā)光波長為587 nm、發(fā)射光波長為615 nm。

1.5 小鼠腦組織水腫程度檢測

本研究采用干濕比重法對小鼠腦組織的含水量進(jìn)行檢測，即能夠反映其右腦半球水腫程度。取對照組小鼠6只、格列苯脲治療組小鼠7只進(jìn)行TBI造模。造模成功后，格列苯脲治療組小鼠于傷后10、40、80、120 min經(jīng)鼻腔給予格列苯脲溶液（2 mg/kg），對照組小鼠則于相同的時間點(diǎn)經(jīng)鼻腔給予同等劑量的藥物溶劑。建模成功后24 h，小鼠呈仰臥位，經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛（0.1 mL/10 g）進(jìn)行麻醉。麻醉成功后，采用斷頭剪開枕骨大孔的方式取出腦組織，用刀片分離左、右腦半球，并立即稱取濕重。而后，將腦組織置于57 ℃干燥箱中，72 h后稱取其干重。通過[（濕重-干重）/濕重×100%]計算，獲得小鼠腦組織的含水量。同時，采用[（右腦半球含水量-左腦半球含水量）/左腦半球含水量×100%]表示右腦半球含水量相比于左腦半球含水量增加的百分比[3,6]。

1.6 小鼠腦組織損傷體積檢測

取對照組及格列苯脲治療組小鼠各5只行TBI造模，造模成功后2組小鼠分別接受鼻腔給藥直至取出其腦組織的操作步驟均同1.5部分。即刻將腦組織放入預(yù)冷的腦模具中。隨后，從嗅球處用10張不銹鋼刀片將腦組織切成1 mm的切片，再用毛刷將其從刀片上輕輕刷下。稱取2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑（2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）粉末0.8 g，將其溶于40 mL PBS中配置成2% TTC溶液。于避光條件下，將腦組織切片置于該溶液中染色，每10 min翻動1次，共計40 min。使用Image J軟件分析損傷面積并計算腦損傷體積百分比。計算公式[7]為：腦組織損傷區(qū)體積百分比= ［各腦組織切片損傷區(qū)面積之和×切片厚度（1 mm）］ / ［各腦組織切片面積之和×切片厚度（1 mm）］ ×100%。

1.7 小鼠神經(jīng)功能變化的觀察

于TBI建模前，取對照組小鼠8只、格列苯脲治療組小鼠9只進(jìn)行為期3 d的轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練，即每日訓(xùn)練3次、每次間隔20 min。第1日，前2次分別以4 r/min的勻速模式訓(xùn)練60 s，后1次以4～40 r/min的加速模式訓(xùn)練300 s；第2、3日，前1次以4 r/min的勻速模式訓(xùn)練60 s，后2次分別以4～40 r/min的加速模式訓(xùn)練300 s。其中，加速模式均在240 s時速度達(dá)到最大[8]。轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練結(jié)束后，采用CCI法構(gòu)建小鼠TBI模型。建模成功當(dāng)天，格列苯脲治療組小鼠于傷后10、40、80、120 min經(jīng)鼻腔給予格列苯脲（2 mg/kg），從次日到第7日，腹腔注射格列苯脲（20 mg/kg），每日1次；對照組小鼠則在同等條件下接受相同劑量的藥物溶劑。建模成功后72 h，對小鼠進(jìn)行為期5 d的轉(zhuǎn)棒測試，即每日測試3次，每次以4～40 r/min的加速模式測試300 s、間隔時間為20 min，記錄小鼠從棒上掉落下來的時間。棒上停留時間越長，說明小鼠運(yùn)動協(xié)調(diào)的神經(jīng)功能越好。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量以±s表示，組間獨(dú)立樣本比較采用非配對t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TBI模型建立

本研究采用CCI法制備小鼠右腦半球TBI模型，結(jié)果顯示建模成功率為100%。在建模手術(shù)中可觀察到格列苯脲治療組和對照組小鼠的顱窗四周有血液涌現(xiàn)且伴有腦組織脫落，表明腦部血管被撞擊破裂、腦組織被挫裂（圖1A）。建模成功后24 h發(fā)現(xiàn)，小鼠的代表性腦組織中左腦半球完好無損，右腦半球TBI區(qū)域（即皮層感覺運(yùn)動區(qū)）有水腫、出血?dú)埩舻炔⒊霈F(xiàn)了發(fā)黑壞死（圖1B）。以上情況說明，小鼠的右腦半球受到了損傷，TBI建模成功。

圖1 TBI建模手術(shù)現(xiàn)場和建模成功24 h后小鼠腦組織情況Fig 1 Surgery scene of TBI and brain tissue of mice after 24 h of successful TBI modeling

2.2 格列苯脲經(jīng)鼻給藥的入腦分析

本研究運(yùn)用熒光探針標(biāo)記格列苯脲示蹤觀察經(jīng)鼻給藥后，格列苯脲在小鼠腦組織中的情況。結(jié)果顯示，在經(jīng)鼻腔遞送熒光探針標(biāo)記的格列苯脲之前，小鼠腦部近嗅球端無明顯的深藍(lán)色熒光（圖2A）；而在給藥后100 min時，從嗅球處往腦區(qū)方向分布有大面積的深藍(lán)色熒光，并向腦部呈擴(kuò)散趨勢（圖2B）。上述結(jié)果可以說明，熒光探針標(biāo)記的格列苯脲已成功到達(dá)小鼠腦部。

圖2 熒光探針示蹤觀察小鼠格列苯脲經(jīng)鼻給藥后的入腦情況Fig 2 Observation of the brain condition of mice after intranasal administration of glibenclamide by fluorescent probe

2.3 格列苯脲對小鼠腦組織水腫程度的影響

本研究采用干濕重比值法對小鼠左、右腦半球組織含水量進(jìn)行檢測并分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在建模成功24 h后，格列苯脲治療組和對照組小鼠的右腦半球含水量均比其左腦半球有所增加（P=0.003，P=0.002），表明2組小鼠在經(jīng)歷TBI后均有繼發(fā)性腦水腫發(fā)生（圖3A）；通過對各組小鼠右腦半球含水量相較于其左腦半球增加的百分比進(jìn)行計算發(fā)現(xiàn)，格列苯脲治療組小鼠的右腦半球含水量增加百分比（即水腫程度）明顯低于對照組（P=0.000，圖3B）。繼而表明，格列苯脲經(jīng)鼻給藥治療后能顯著減輕由TBI誘發(fā)的繼發(fā)性腦水腫。

圖3 2組小鼠右腦半球繼發(fā)性腦水腫的檢測Fig 3 Detection of secondary brain edema in the right hemisphere in the two groups of mice

2.4 經(jīng)鼻給藥對小鼠腦組織損傷體積的影響

本研究對2組小鼠TBI建模成功后24 h的腦組織切片進(jìn)行TTC染色并分析，結(jié)果顯示，對照組小鼠的腦組織中白色損傷區(qū)域相比格列苯脲治療組有所增加（圖4A、B）。通過Image J軟件進(jìn)一步量化分析發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠腦組織的損傷體積百分比[（11.6±2.2）%]顯著高于格列苯脲治療組[（7.4±1.1）%]（P=0.003，圖4C）。上述結(jié)果可以表明，格列苯脲經(jīng)鼻給藥治療后能顯著減少由TBI誘發(fā)的腦組織損傷的體積。

圖4 2組小鼠腦組織切片的TTC染色和損傷體積百分?jǐn)?shù)的統(tǒng)計分析Fig 4 TTC staining of brain tissue sections and statistical analysis of the percentage of brain damage volume of the two groups

2.5 格列苯脲對小鼠神經(jīng)功能的影響

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在TBI后3～7 d，從總體上看2組小鼠在棒上停留的時間有所增加，表明小鼠的運(yùn)動功能得到了恢復(fù)；但2組小鼠在棒上停留時間的差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，表明格列苯脲對小鼠的神經(jīng)功能沒有明顯的改善作用（圖5）。

圖5 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)觀察2組小鼠在棒上停留的時間Fig 5 The time of staying on the rod in the two groups of mice by rotarod test

3 討論

TBI誘發(fā)的腦損傷主要包括血腦屏障破壞、炎性反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡、興奮性氨基酸毒性和脂質(zhì)過氧化[9-12]，進(jìn)而可繼發(fā)腦腫脹、腦損傷、遲發(fā)性腦水腫和腦疝等疾病進(jìn)程，其誘發(fā)的腦水腫可伴有認(rèn)知、記憶、語言、情感等神經(jīng)功能障礙[13-15]，與缺血性腦卒中的損傷機(jī)制較為相似。正常情況下，SUR1-TRPM4通道蛋白在腦組織內(nèi)少量表達(dá)；而在缺血、缺氧及外傷等腦組織損傷情況下，其能夠在星形細(xì)胞、神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞中激活表達(dá)，從而使K+、Na+等自由通過SUR1-TRPM4通道，最終導(dǎo)致胞膜去極化、細(xì)胞毒性腦水腫和腫脹性壞死的發(fā)生[16-17]。格列本脲作為一種降糖藥，其藥物靶點(diǎn)主要為SUR1。已有文獻(xiàn)[18-19]報道，腦卒中發(fā)生時格列苯脲可與腦組織中的SUR1-TRPM4中的SUR1特異性結(jié)合，從而阻斷SUR1-TRPM4通道，發(fā)揮減輕腦水腫、改善神經(jīng)功能轉(zhuǎn)歸及降低死亡率的作用。

近年來，鼻腔給藥已逐漸成為了治療腦部疾病的一種特殊的給藥方式。研究[20]顯示，該方式給藥可使藥物由鼻腔到達(dá)嗅黏膜上皮，再通過嗅黏膜上皮通路和嗅神經(jīng)通路繞過血腦屏障直接到達(dá)腦部。脂溶性藥物可通過濃度依賴型被動擴(kuò)散、受體或載體介導(dǎo)的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)至腦部，水溶性藥物則可經(jīng)細(xì)胞間隙或小孔穿透表皮，實(shí)現(xiàn)藥物至腦部的遞送。本研究采用小動物活體成像實(shí)驗(yàn)對藥物入腦情況進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，格列苯脲可透過嗅黏膜沿著包繞在嗅神經(jīng)束周圍的連接組織或嗅神經(jīng)元的軸突到達(dá)腦部，所以針對TBI模型經(jīng)鼻給藥格列苯脲是可行的治療手段；但不足之處在于該種活體成像方法不能獲得藥物的使用劑量，即格列苯脲在腦部發(fā)揮治療作用的具體濃度。

本研究采用CCI法對小鼠腦部進(jìn)行撞擊并建立TBI模型，通過干濕重比值法發(fā)現(xiàn)在TBI建模成功24 h后格列苯脲治療組小鼠的腦水腫得到了一定的緩解，分析其原因可能是藥物與病理狀態(tài)下上調(diào)的SUR1-TRPM4中的SUR1受體結(jié)合，通過阻斷該通道的開放減輕腦水腫。TBI誘發(fā)的腦水腫主要包括細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫，涉及的離子轉(zhuǎn)運(yùn)體主要有SUR1-TRPM4通道和Na+/ K+-ATPase（鈉鉀泵）等，SUR1-TRPM4通道參與的細(xì)胞毒性腦水腫發(fā)生在TBI損傷后的1～2 h。臨床資料顯示腦外傷后發(fā)生水腫的高峰時間在3～7 d，即為血管源性腦水腫的發(fā)生階段。但也有研究[21]針對腦部出血性挫傷的成年患者行CT掃描發(fā)現(xiàn)，TBI后6 h時患者腦部的損傷病變區(qū)呈現(xiàn)高密度出血；而到36 h時，病變區(qū)周圍被低密度的光暈（主要由血管性的和細(xì)胞毒性的腦水腫造成）圍繞。這也就是說，在TBI的早期階段細(xì)胞毒性腦水腫就已出現(xiàn)，且逐漸發(fā)展并擴(kuò)散；繼而說明，在研究腦水腫的治療策略上除了關(guān)注腦水腫高峰期（即腦外傷后3～7 d），研究者們還可以關(guān)注腦外傷后早期的腦水腫發(fā)生階段。

本研究在TBI建模成功后24 h就格列苯脲對腦水腫的治療效果進(jìn)行檢測，目的即是觀察經(jīng)鼻給藥后的格列苯脲是否能夠在早期遏制腦水腫的發(fā)生。此外，近年來也有部分研究者針對腦水腫發(fā)生的急性期進(jìn)行研究，認(rèn)為在發(fā)生腦外傷后及時抑制與腦水腫發(fā)生相關(guān)的通道或蛋白的表達(dá)或活性可以減緩腦水腫的疾病進(jìn)程[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，格列苯脲除了可以緩解由TBI造成的繼發(fā)性腦水腫，還可以減少由TBI造成的腦組織損傷。

通過對TBI發(fā)生后小鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，格列苯脲不能改善腦損傷小鼠的神經(jīng)功能，與既往研究[25]結(jié)果相一致。推測其原因，可能是TBI涉及多種細(xì)胞死亡機(jī)制（水腫、壞死、凋亡、氧化應(yīng)激等），而格列苯脲僅僅作用于早期的細(xì)胞毒性腦水腫，不能全面覆蓋神經(jīng)功能受損所涉及的多重病理機(jī)制。同時，格列苯脲的作用靶點(diǎn)是SUR1，而SUR1表達(dá)上調(diào)也僅是TBI誘發(fā)繼發(fā)性腦損傷機(jī)制的一部分，最終的療效提高仍需要依賴多種治療手段的聯(lián)合應(yīng)用。綜上，本研究就格列苯脲經(jīng)鼻給藥對TBI的治療效果進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)該藥物能顯著減輕TBI誘發(fā)的腦水腫、減少腦損傷體積，為臨床上TBI的藥物治療提供了新思路。