石新華

(新鄭市中醫(yī)院，河南 新鄭 451100)

嘧啶是核酸合成和DNA修復(fù)的重要組成部分。在增殖正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，從頭進(jìn)行嘧啶合成途徑的激活對于滿足DNA復(fù)制所需的核苷酸的高需求是至關(guān)重要的[1-2]。在動物體內(nèi)，該途徑的前3個反應(yīng)由CAD催化[3]。CAD是啟動和控制動物嘧啶從頭開始生物合成的多功能蛋白。CAD的上調(diào)對細(xì)胞增殖至關(guān)重要。因此，CAD有可能被用作抗腫瘤靶標(biāo)。最近的研究表明靶向CAD基因可以改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后[4]。

鑒于腫瘤發(fā)生的復(fù)雜性，對任何目標(biāo)基因進(jìn)行泛癌表達(dá)分析并評估其與臨床預(yù)后和潛在分子機(jī)制的相關(guān)性非常重要。我們的研究首次使用癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫對CAD基因進(jìn)行了泛癌分析，以探索CAD基因在不同組織中的表達(dá)以及在腫瘤臨床預(yù)后中的潛在分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取與預(yù)處理從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了33種腫瘤的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，同時下載了相應(yīng)患者的臨床信息、腫瘤突變負(fù)擔(dān)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的信息。33種腫瘤包括：腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma，ACC)、膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)、乳腺浸潤癌(breast invasive carcinoma，BRCA)、宮頸鱗癌和腺癌(cervical and endocervical cancers, CESC)、膽管癌(cholangiocarcinoma, CHOL)、結(jié)腸癌(colon adenocarcinoma, COAD)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma, DLBC)、食管癌(esophageal carcinoma, ESCA)、多形成性膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma ,HNSC)、腎嫌色細(xì)胞癌(kidney chromophobe ,KICH)、腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma ,KIRC)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma ,KIRP)、急性髓細(xì)胞樣白血病(acute myeloid leukemia ,LAML)、腦低級別膠質(zhì)瘤(brain lower grade glioma, LGG)、肝細(xì)胞肝癌(liver hepatocellular carcinoma, LIHC)、肺腺癌(lung adenocarcinoma ,LUAD)、肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma ,LUSC)、間皮瘤(mesothelioma ,MESO)、卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma ,OV)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma ,PAAD)、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(pheochromocytoma and paraganglioma ,PCPG)、前列腺癌(prostate adenocarcinoma ,PRAD)、直腸腺癌(rectum adenocarcinoma ,READ)、肉瘤(sarcoma ,SARC)、皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma ,SKCM)、胃癌(stomach adenocarcinoma ,STAD)、睪丸癌(testicular germ cell tumors ,TGCT)、甲狀腺癌(thyroid carcinoma ,THCA)、胸腺癌(thymoma ,THYM)、子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma ,UCEC)、子宮肉瘤(uterine carcinosarcoma, UCS)、葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma ,UVM)。

1.2 預(yù)后評估與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用Cox回歸分析評估每種腫瘤類型的CAD基因表達(dá)與患者總生存期、疾病特異性生存期和疾病無進(jìn)展生存期之間的相關(guān)性。根據(jù)CAD基因表達(dá)的中位值，將患者分為CAD高表達(dá)組與CAD低表達(dá)組，使用Kaplan -Meier方法繪制每種腫瘤類型的患者生存曲線，使用log-rank檢驗(yàn)分析生存狀況。使用的“ESTIMATE”軟件包計(jì)算每例患者的基質(zhì)評分和免疫評分來評估患者的腫瘤微環(huán)境[5]。使用“CIBERSORT”算法計(jì)算每例患者22種免疫細(xì)胞浸潤情況[6]。使用Spearman相關(guān)評估CAD基因表達(dá)與靶標(biāo)間的相關(guān)性(基質(zhì)評分，免疫評分，免疫細(xì)胞浸潤，腫瘤突變負(fù)荷，微衛(wèi)星不穩(wěn)定)。使用t檢驗(yàn)評估腫瘤與正常組織之間的CAD基因表達(dá)水平。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各種正常組織和腫瘤組織中的CAD表達(dá)水平在TCGA數(shù)據(jù)庫中共有24種腫瘤存在相應(yīng)的正常組織作為對照。在這24種腫瘤中有19種腫瘤的CAD基因表達(dá)與正常組織比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，KICH中的CAD基因表達(dá)低于對應(yīng)的正常組織，其余18種腫瘤中的CAD基因表達(dá)均高于對應(yīng)的正常組織。見圖1。

圖1 33種腫瘤及其相應(yīng)正常組織中CAD基因表達(dá)的箱圖[1)P<0.05]

2.2 CAD基因表達(dá)水平與預(yù)后之間的關(guān)系CAD基因表達(dá)是ACC、BLCA、COAD、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、MESO、SARC、SKCM、UCEC的危險因素，而CAD基因表達(dá)是READ的保護(hù)因素(P均<0.05)。進(jìn)一步根據(jù)CAD基因表達(dá)的中位值將33種腫瘤患者分為CAD高表達(dá)組與CAD低表達(dá)組后進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，在ACC、KIRC、LGG、LIHC、MESO、SARC、UCEC患者中，CAD高表達(dá)組患者與CAD低表達(dá)組患者間的總體生存期比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。比較一致的是，CAD高表達(dá)組患者的總體生存期均小于CAD低表達(dá)組(P均<0.05)?？紤]到總體生存期可能會受到非腫瘤死亡的影響，我們進(jìn)一步評估了CAD基因表達(dá)與疾病特異生存間的關(guān)系。相似的是，CAD基因表達(dá)是ACC、BLCA、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、MESO、PCPG、PRAD、SARC、SKCM、THCA的危險因素。在GBMLGG、KIRC、LIHC、MESO、PRAD、UCEC、UVM患者中,CAD高表達(dá)患者疾病特異生存期減少(P均<0.05)。CAD基因表達(dá)與疾病無進(jìn)展生存期的關(guān)系研究結(jié)果顯示，CAD基因表達(dá)是ACC、BLCA、KIRC、腦LGG、LIHC、MESO、PAAD、PCPG、PARD、SARC、UCEC、UVM的危險因素。根據(jù)CAD基因表達(dá)的中位值將患者分為2組，在ACC、GBMLGG、LIHC、MESO、PCPG、PRAD、UCEC、UVM患者中，CAD高表達(dá)組疾病無進(jìn)展生存期較CAD低表達(dá)組。見圖2～4。

圖2 33種腫瘤中CAD基因表達(dá)與總體生存期關(guān)系的森林圖(X軸刻度線遵循對數(shù)刻度)

圖3 33種腫瘤中CAD基因表達(dá)與疾病特異生存期關(guān)系的森林圖(X軸刻度線遵循對數(shù)刻度)

圖4 33種腫瘤種CAD基因表達(dá)與疾病無進(jìn)展生存期關(guān)系的森林圖

2.3 CAD基因表達(dá)與腫瘤微環(huán)境間的關(guān)系CAD表達(dá)與一些腫瘤的基質(zhì)評分、免疫評分密切相關(guān)。在11種腫瘤中CAD基因表達(dá)與基質(zhì)評分呈負(fù)相關(guān)，其中LAML、SARC、TGCT最顯著(r=-0.42、-0.42、-0.47，P均<0.05)。在14種腫瘤中CAD基因表達(dá)與免疫評分呈負(fù)相關(guān)，其中LAML、OV、SARC最顯著(r=-0.39、-0.38、-0.33，P均<0.05)。在11種腫瘤中CAD基因表達(dá)與M0巨噬細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，其中LIHC、SARC、SKCM最顯著(r=0.24、0.24、0.21，P均<0.05)。

2.4 CAD基因表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定間的關(guān)系33種腫瘤中，ACC、BRCA、HNSC、KICH、KIRC、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、SKCM、STAD等12種腫瘤的CAD基因表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷均存在顯著正相關(guān)關(guān)系，其中ACC、KICH、LUAD的相關(guān)系數(shù)最高。33種腫瘤中，BLCA、CESC、COAD、DLBC、ESCA、GBM、KICH、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、OV、READ、UVM等14種腫瘤的CAD基因表達(dá)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定存在顯著相關(guān)性，DLBC、COAD、READ中CAD基因與微衛(wèi)星不穩(wěn)定呈負(fù)相關(guān)，而剩余11種腫瘤中CAD基因表達(dá)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定呈正相關(guān)，其中KICH、LUSC、UVM的相關(guān)系數(shù)最高。見圖5。

圖5 CAD基因表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷(A)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(B)的關(guān)系[1)P<0.05]

3 討論

本文結(jié)果顯示，CAD基因在多種腫瘤組織中表達(dá)增高，并且這種高表達(dá)與這些腫瘤較差的總體生存期和疾病特異性生存期有關(guān)。例外的是，當(dāng)將CAD基因視為連續(xù)性變量時，CAD基因表達(dá)是COAD的保護(hù)因素。此外，部分患者中CAD基因表達(dá)與疾病進(jìn)展相關(guān)，其中CAD基因高表達(dá)患者腫瘤復(fù)發(fā)較早。因此，需要加強(qiáng)對這些患者的護(hù)理與隨訪。識別出高?；颊撸贫▊€性化治療方案，加強(qiáng)對這部分患者的護(hù)理與隨訪將有希望改善其預(yù)后。CAD是啟動和控制動物嘧啶從頭開始生物合成的多功能蛋白。嘧啶是核酸合成和DNA修復(fù)的重要組成部分。在增殖正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，從頭進(jìn)行嘧啶合成途徑的激活對于滿足DNA復(fù)制所需核苷酸的高需求是至關(guān)重要的。盡管先前有研究證實(shí)了CAD基因表達(dá)與LIHC、LUAD、PRAD等腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)，但尚未有基于泛癌數(shù)據(jù)的研究[7-9]。我們的研究發(fā)現(xiàn)了CAD基因表達(dá)與各種腫瘤之間的相關(guān)性，包括與腫瘤生存和預(yù)后的明確聯(lián)系，使其成為用于腫瘤監(jiān)測和進(jìn)一步研究的生物標(biāo)志物。

浸潤的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞構(gòu)成腫瘤組織中正常細(xì)胞的主要部分，在腫瘤生物學(xué)中起著重要作用。我們使用“ESTIMATE”算法評估了33種腫瘤患者的基質(zhì)評分和免疫評分，并探索了CAD基因表達(dá)與兩者的關(guān)系。我們的相關(guān)分析的結(jié)果顯示，在大部分腫瘤中，CAD基因表達(dá)與基質(zhì)評分、免疫評分呈負(fù)相關(guān)。即CAD基因高表達(dá)患者基質(zhì)評分、免疫評分較低。此外，先前的研究表明，在大部分腫瘤中，高基質(zhì)評分、免疫評分與低腫瘤純度相關(guān)和良好的預(yù)后相關(guān)，這與我們的結(jié)果一致[10-12]。另外，我們通過“CIBERSORT”評估患者的免疫細(xì)胞浸潤情況，并探索CAD基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤間的關(guān)系。結(jié)果顯示，在許多腫瘤中CAD基因表達(dá)與M0巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)。一致的是，最近的研究表明巨噬細(xì)胞浸潤通常與免疫抑制性微環(huán)境有關(guān)。此外，研究[13-15]表明高M(jìn)0巨噬細(xì)胞浸潤與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)?？傊?，CAD基因表達(dá)與多種腫瘤的腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。盡管先前的研究[2]表明，嘧啶合成對于T淋巴細(xì)胞增殖至關(guān)重用。遺憾的是，CAD基因影響腫瘤微環(huán)境的確切機(jī)制尚未確定，因此需要進(jìn)一步探究CAD基因影響腫瘤微環(huán)境的機(jī)制。

我們還研究了CAD基因表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定間的關(guān)系。如今已證實(shí)腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定可以預(yù)測患者的多種藥物反應(yīng)，特別是免疫檢查點(diǎn)抑制劑類藥物[16-18]。研究[19-21]表明，高腫瘤突變負(fù)荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定與良好的免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物反應(yīng)相關(guān)。而我們的結(jié)果顯示，在KIRC、LUAD、LUSC等腫瘤中CAD基因表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定呈正相關(guān)。這提示CAD基因表達(dá)可能是潛在的藥物反應(yīng)指標(biāo)，需要進(jìn)一步的研究來證明這一結(jié)果。

盡管我們的研究提供了CAD基因參與腫瘤發(fā)生和腫瘤細(xì)胞免疫環(huán)境調(diào)節(jié)的有用信息，但其確實(shí)存在一些局限性。首先，作為一種純粹的生物信息學(xué)分析，其完全依賴于開放存取數(shù)據(jù)庫中可用的信息，而沒有通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。在我們的研究中，CAD基因表達(dá)的評估完全基于上述數(shù)據(jù)庫，即使這可能無法反映功能蛋白的水平。例如，轉(zhuǎn)錄后修飾和(或)調(diào)節(jié)的蛋白水解作用可能在正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中影響蛋白質(zhì)活性。未來的研究將側(cè)重于通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證我們的數(shù)據(jù)，并探索CAD基因在腫瘤發(fā)生中的可能機(jī)制。其次，CAD基因影響腫瘤微環(huán)境的途徑尚未知，需要可靠實(shí)驗(yàn)證明CAD基因與腫瘤免疫微環(huán)境間的聯(lián)系。

我們的結(jié)果表明，CAD基因與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在多種腫瘤中CAD基因高表達(dá)患者預(yù)后差。因此，對于CAD基因高表達(dá)患者應(yīng)加強(qiáng)護(hù)理與隨訪。CAD基因表達(dá)與腫瘤微環(huán)境有密切聯(lián)系。