張 燕，索 峰，緱靈山，王 億，孫成才，王傳霞，顧茂勝

(徐州市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心，江蘇徐州 221000)

歐洲泌尿科學(xué)會(huì)(EAU)男性不育指南[1]中指出男性因素在致使育齡夫婦不孕不育的因素中約占45%～50%，且根據(jù)近年的研究發(fā)現(xiàn)，約有50%的男性不育皆因遺傳缺陷[2]所致。Y染色體長臂上存在著與精子生成相關(guān)的基因，稱為無精子癥因子(Azoospermia factor,AZF),主要包括AZFa，AZFb以及AZFc三個(gè)區(qū)域[3]，這三個(gè)區(qū)域相互獨(dú)立，互不干擾，任何一個(gè)區(qū)域的微缺失都將導(dǎo)致精子生成障礙，進(jìn)而影響男性生育能力，其發(fā)生率在因精子生成障礙導(dǎo)致不育的因素中僅次于克氏綜合征(klinefelter syndrome)，位居第二。故本研究對509例男性不育患者采用多重PCR技術(shù)進(jìn)行Y染色體微缺失檢測，探討其對男性不育的臨床診療價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2016年11月～2019年7月于徐州市婦幼保健院就診的509例男性不育患者，年齡17～52歲，平均年齡33.2±5.9歲，其中包括初診為不孕不育患者369例，已確診為不同程度精子狀態(tài)異常(包括少、弱、畸、死、無精子)患者117例，確診為睪丸發(fā)育異常(包括不發(fā)育和發(fā)育不良)患者23例，所有入選患者均已排除生殖道感染、精索靜脈曲張、輸精管缺如等其他男性生殖系統(tǒng)疾病。采用真空采血管采集患者靜脈全血2ml(EDTA抗凝)。

1.2 試劑和儀器 廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的Lab-Aid 824核酸提取儀及其配套生產(chǎn)的Lab-Aid 824核酸提取Mini試劑,上海透景生命科技股份有限公司生產(chǎn)的SLAN 965實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及Y染色體微缺失檢測試劑盒(PCR熒光探針法)。

1.3 方法

1.3.1 全血DNA提?。禾崛颖净蚪MDNA(ng/μl)，操作步驟按照試劑說明書進(jìn)行。

1.3.2 Y染色體微缺失基因檢測

1.3.2.1 PCR反應(yīng)體系：檢測Y染色體AZF區(qū)3對序列標(biāo)簽位點(diǎn)，包括AZFa(sY84,sY86),AZFb(sY127,sY134),AZFc(sY255,sY254),以及1對內(nèi)對照位點(diǎn)SRY,ZFX/ZFY，每對位點(diǎn)對應(yīng)探針依次用四種不同熒光染料(VIC,ROX,Cy5,FAM)標(biāo)記。每個(gè)樣本做A，B兩組試驗(yàn)，A組檢測位點(diǎn)為SRY,sY84,sY127,sY255；B組檢測位點(diǎn)為ZFX/ZFY,sY86,sY134,sY254。操作步驟按照試劑說明書進(jìn)行。

1.3.2.2 PCR反應(yīng)程序：第一階段：50℃ 2min,1個(gè)循環(huán)；第二階段：95℃ 5min，1個(gè)循環(huán)；第三階段：95℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，38個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)60℃時(shí)收集FAM/VIC/ROX/Cy5信號，并保存相關(guān)文件；第四階段：72℃ 5min，1個(gè)循環(huán)。

1.3.3 結(jié)果判讀：若擴(kuò)增曲線出現(xiàn)相應(yīng)典型S型曲線且Ct值小于32，則說明檢測區(qū)域不存在基因缺失，反之，則存在缺失。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用行×列表資料χ2檢驗(yàn)。取P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AZF微缺失結(jié)果分析 見表1。509例患者檢出Y染色體缺失24例，檢出率4.72%。三組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.004，P=0.002)。

表1 509例不育患者AZF微缺失發(fā)生率

2.2 AZF基因不同區(qū)域微缺失結(jié)果分析 見表2。24例Y染色體微缺失樣本中，檢出AZFc微缺失18例，檢出率最高(75%)，其次為AZFabc三區(qū)同時(shí)缺失，AZFbc兩區(qū)同時(shí)缺失及AZFb缺失檢出率最低且相等。三組數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.093，P=0.020)。

表2 24例AZF基因微缺失不同缺失區(qū)域發(fā)生率[n(%)]

3 討論

Y染色體是人類46條染色體中最短小的染色體，存在著大量的重復(fù)序列和回文序列，這兩種序列的存在使得Y染色體很容易發(fā)生缺失。當(dāng)缺失發(fā)生在AZF區(qū)域時(shí)，就有可能造成男性不育。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)不同地區(qū)Y染色體微缺失發(fā)生率也不同，洛陽地區(qū)發(fā)生率為10.12%[4]，新疆地區(qū)發(fā)生率為6%[5]，貴州地區(qū)發(fā)生率為7.13%[6]，廣東清遠(yuǎn)地區(qū)發(fā)生率為6.1%[7]，寧夏地區(qū)發(fā)生率為9%[8]。本研究509例患者檢出24例AZF微缺失，檢出率4.72%，稍低于其他地方，這與不同種族、研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)、臨床診斷類型以及標(biāo)本量多少有關(guān)。

AZFa，AZFb，AZFc三個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)五種缺失模式：AZFa，AZFb，AZFc，AZFbc和AZFabc，本研究檢出的24例微缺失中除AZFa缺失未檢出外，其余缺失模式均被檢出。其中AZFc缺失率最高(75%)，與2013年版歐洲男科協(xié)會(huì)(EAA)Y染色體微缺失診斷指南[9]中統(tǒng)計(jì)的AZFc缺失率(～80%)接近；AZFabc三區(qū)同時(shí)缺失檢出率為16.66%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于指南中AZFabc的缺失率(0.5%～4%)；AZFb和AZFbc的缺失率均為4.17%，與指南中統(tǒng)計(jì)的缺失率(1～5%，1～3%)接近。

AZFa區(qū)的基因主導(dǎo)精母細(xì)胞增生，整個(gè)AZFa區(qū)的缺失表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合癥(sertoli cell only syndrome,SCOS)，為絕對的無精子癥，并伴有小睪丸癥狀[10]。本研究中未發(fā)現(xiàn)僅AZFa區(qū)缺失，但AZFabc三區(qū)同時(shí)缺失檢出4例。AZFb區(qū)缺失的患者，生精阻礙在初級精母細(xì)胞階段，沒有精子生成。故患者只要檢出包含AZFa和/或AZFb區(qū)的缺失都不建議做單精子胞漿內(nèi)注射手術(shù)(intracytoplasmic sperm injection ,ICSI)[11]。

AZFc區(qū)缺失在臨床上最常見，也是臨床表現(xiàn)最為樂觀的一種缺失。AZFc區(qū)缺失的患者其精子數(shù)量從無到正常，并通常伴有形態(tài)及活力異常。有研究顯示[12]，AZFc區(qū)缺失的患者有一定的成功率可以通過ICSI來孕育后代，但這種缺失會(huì)遺傳給男性后代[13]，故該類患者可行(孕前診斷PGD)輔助生殖，選擇生育女性后代。本研究中有大量患者初次檢查均籠統(tǒng)診斷為不育，后期檢查后未更新精子狀態(tài)等具體不育病因，在后續(xù)研究中還需隨訪更新，對于提高小組檢出率有很大幫助。

綜上所述，Y染色體AZF基因微缺失對于男性不育意義重大，通過檢測可以幫助臨床盡快明確部分男性不育的根本原因，從而指導(dǎo)臨床制定出更加合理有效的輔助生殖診療方案，更好地造福于患者。