唐映華，楊 蘭，莫武寧

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021;2.南寧市第二人民醫(yī)院，南寧 530031；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023)

代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)是心血管及糖尿病的重要影響因素，可使心臟病患病風(fēng)險增加2～3倍[1]。近年來MS的患病率明顯上升[2]。脂聯(lián)素(adiponectin, APN)是由脂肪組織分泌的激素蛋白,與高血壓、糖尿病、冠心病和MS等疾病相關(guān)[3-5]。APN基因位于染色體的3q27區(qū)域，是2型糖尿病、MS及冠心病的易感基因區(qū)，具有豐富的基因多態(tài)性[6]。rs2241766是APN常見的多態(tài)性位點，本研究旨在通過檢測MS患者APN水平及其基因位點rs2241766基因多態(tài)型(TT,TG,GG)及等位基因(T,G)的分布頻率，探討它們與MS發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取410例MS患者為MS組，其中男性234例，女性176例，年齡35～65(平均年齡50.4)歲，所有MS患者均按照《中國成年人血脂異常防治指南》[7]確診為MS的患者。203例健康人群為對照組，其中男性109例，女性94例，年齡32～61(平均年齡45.9)歲。所有研究對象在納入時均完成了身高(167.2±13.7cm vs 167.8±14.4cm)、體重(66.4±5.9kg vs 61.9±7.1kg)、腰圍(88.4±6.6cm vs 81.3±4.6cm)、臀圍(105.4±11.3cm vs 93.9±8.2cm)及血壓(收縮壓137.5±20.5mmHg vs 109.5±15.7mmHg，舒張壓82.4±12.5mmHg vs 72.1±8.2mmHg)的測量。測量結(jié)果顯示MS組體重、腰圍、臀圍及血壓等指標(biāo)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但兩組在性別、年齡及身高上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究遵循知情同意原則，所有研究對象均屬自愿參加。

1.2 儀器與試劑 日立7600全自動生化儀(日本日立公司)，9700擴增儀(美國 ABI公司)，RT-6000酶標(biāo)儀(深圳雷杜公司)，超微量紫外分光計(美國賽默飛世爾公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像儀(珠海黑馬生物公司)，APN試劑(美國GBD公司)，DNA抽提試劑(北京天根公司)。TG，TC，LDL-C，HDL-C及FPG試劑(羅氏公司) 。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集:抽取每個受試者靜脈血5ml，分別置入干燥管和乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中。將血樣本以3 000 r/min 離心10 min，收集上清液至-20℃冷凍保存以備檢測。血清用于三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、空腹血糖(FPG)及 APN 檢測，EDTA抗凝血用于APN 基因位點多態(tài)性檢測。

1.3.2 生化參數(shù)及APN檢測：血清TG，TC，LDL-C，HDL-C及FPG檢測按日立7600全自動生化儀及相關(guān)試劑盒說明書檢測。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測APN水平，并根據(jù)試劑說明書進行處理。

1.3.3 APN基因檢測

1.3.3.1 全血DNA的制備：嚴(yán)格按照試劑說明書操作。采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技術(shù)對APN基因進行檢測。APN基因位點 rs2241766多態(tài)性檢測上游引物為5’-CTTGGTGAGGAGAGAGAGAC-3’，下游引物為5’-GGAGAATCAGATAATGATG-3’。

1.3.3.2 反應(yīng)體系：在50μl總體積的反應(yīng)體系中進行，包含DNA模版2μl ，PCR混合反應(yīng)液8μl(含脫氧核苷三磷酸緩沖液)，上下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶0.5 μl和水37.5μl。

1.3.3.3 擴增條件:94℃ 5min預(yù)變性；94℃ 1min，55℃ 45s，72℃ 1min持續(xù)35個循環(huán)；72℃延伸 5min。

1.3.3.4 限制性片段長度多態(tài)性分析:取PCR擴增產(chǎn)物20μl，限制酶1μl，緩沖液3μl，水6μl，在37℃酶切1h后，最后經(jīng)2g/dl 瓊脂糖凝膠電泳分析酶切后的DNA產(chǎn)物，并判斷基因型。每個研究參與者被分為三種可能的基因型之一。

2 結(jié)果

2.1 MS組與對照組血清中生化指標(biāo)及APN水平 見表1。MS組血清APN和HDL-C水平低于對照組，而FPG，TG，TC及LDL-C等水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 rs2241766位點基因型及等位基因頻率 見表2。經(jīng)H-W平衡檢驗，rs2241766 的基因型和等位基因頻率分布達到平衡(χ2=3.319,P=0.068;χ2=3.808,P= 0.079)。rs2241766位點的TT，TG及GG基因型在MS組與對照組間的總體分布上差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=39.222，P<0.001)，MS組GG基因型高于對照組且G等位基因頻率也明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=36.657，P< 0.001)。

表1 MS組與對照組血清生化指標(biāo)及APN水平比較

表2 MS患者與對照組rs2241766 基因檢測結(jié)果 [n(%)]

2.3 rs2241766 不同基因型發(fā)生MS的風(fēng)險比較 logistic回歸分析顯示:rs2241766位點的TG (OR=1.55 ， 95% CI：0.79～2.83)和GG(OR=2.48 ， 95% CI：1.67～7.35)基因型發(fā)生MS的風(fēng)險高于TT(OR=1.00ref)基因型，將TG和GG基因型合并，TG+GG(OR=2.23，95% CI：1.21～6.09)基因型發(fā)生MS風(fēng)險同樣高于TT，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019,0.006，0.029)。等位基因T,G與MS發(fā)生的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MS組G等位基因發(fā)生MS的風(fēng)險高于T等位基因(OR=2.19 ， 95% CI：1.17～3.01 vs OR=1.00ref)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034)。

2.4 MS組脂聯(lián)素基因多態(tài)性與血清APN水平的關(guān)系 進一步對各基因型間的APN水平進行分析，發(fā)現(xiàn)GG基因型(14.3±4.5 mg/ml)和TG基因型(15.7±4.1 mg/ml)的APN水平明顯低于TT基因型(18.7±4.9 mg/ml)， 將TG和GG基因型合并后發(fā)現(xiàn)TT+GG基因型(14.9±5.1mg/ml)的APN水平同樣低于TT基因型(F=7.621,P<0.001)。而TG，GG及TG+GG組間ANP水平無差異。

3 討論

MS是一組復(fù)雜的代謝紊亂，由多基因和多種環(huán)境相互作用導(dǎo)致的疾病。該病近年在60歲以上人群的患病率從25.5%上升到32.4%[8]，是糖尿病與心血管疾病(CVD)的重要危險因素。許多MS患者最終會發(fā)展為CVD和腎臟疾病，導(dǎo)致心腦血管病的發(fā)生率和病死率居高不下[9]。

APN是脂肪組織特異性分泌的激素蛋白，可促進代謝功能并提供心血管保護[10]，目前被認(rèn)為是 MS的生物學(xué)標(biāo)記物[11]。本研究結(jié)果顯示MS患者血清APN水平明顯低于健康人群(P<0.001)，表明APN水平降低與MS的發(fā)生密切相關(guān)，提示APN在MS的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，這與相關(guān)報道一致[12-14]。在APN基因rs2241766位點多態(tài)性基因型(TT,TG,GG)和等位基因(T,G)頻率分析中發(fā)現(xiàn)，MS組GG基因型分布頻率明顯高于對照組(P<0.001)，G等位基因在MS組較對照組更為常見。對年齡進行調(diào)整后logistic回歸分析顯示TG和GG基因型的研究對象相對于TT基因型發(fā)生MS的風(fēng)險分別增高1.55倍和2.48倍。與T等位基因研究對象相比，G等位基因研究對象發(fā)生MS的風(fēng)險增高2.19倍。進一步對TT，TG及GG基因型組間的APN水平進行比較，結(jié)果顯示GG基因型和TG基因型研究對象的APN水平明顯低于TT基因型。提示TG和GG基因型研究對象可能會使APN水平降低，更容易發(fā)生MS，表明這種基因型是MS的危險因素。這與之前[15-17]的研究報道基本一致。此外，毛維維等[18]學(xué)者提出肥胖患者更容易出現(xiàn)代謝功能異常。顧進等[19]人也指出肥胖是一種低度炎癥性的代謝紊亂。本研究結(jié)果顯示，MS患者與對照組間的血糖、血脂、血壓和體重的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。MS組FPG，TG，TC，LDL-C，體重及血壓等指標(biāo)明顯升高。間接反映了肥胖者脂肪組織 TG，TC 貯存代謝能力和胰島素抵抗程度有關(guān)，致使APN水平降低。

綜上，APN基因rs2241766位點變異可能與MS發(fā)生相關(guān)。尤其是T向G變異的個體可能導(dǎo)致APN水平降低，更容易發(fā)生MS。