王瑞瑤，霍夢(mèng)露，李超，關(guān)錫梅，倪偉建，唐麗琴

[1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230031；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)藥劑科]

糖尿病是一類以胰島素分泌的絕對(duì)或相對(duì)不足而引起的持續(xù)性高糖為特征，并伴有脂肪，蛋白質(zhì)代謝紊亂的內(nèi)分泌性疾病[1]。糖尿病心肌病(DCM)是由糖尿病引起的、與血管疾病同時(shí)伴行或單獨(dú)發(fā)生的特殊性心肌病，是糖尿病最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[2]。糖尿病心肌病狀態(tài)下由于心臟代謝紊亂，微血管病變引發(fā)心臟廣泛灶性壞死，出現(xiàn)亞臨床心功能異常，最終發(fā)展為心律失常、心力衰竭以及心源性休克[3]。目前糖尿病心肌病發(fā)病原因尚不清楚，研究顯示，慢性高血糖會(huì)通過電子鏈?zhǔn)够钚匝?ROS)大量生成，進(jìn)而誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。2型糖尿病患者通常伴隨高胰島素血癥，在高胰島素和胰島素抵抗情況下心臟對(duì)于葡萄糖利用明顯減弱，從而使心臟更多依賴于脂肪酸氧化進(jìn)行能量代謝，相應(yīng)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1及GLUT4表達(dá)減少，導(dǎo)致心臟能量代謝效率大幅降低[4]，其中GLUT4主要在胰島素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪細(xì)胞中表達(dá)，因此刺激GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)將會(huì)是改善心臟葡萄糖代謝障礙重要的一環(huán)[5-8]。小檗堿(BBR)是黃連根莖中的主要成分，有降血糖、降血脂之功效，為黃連治療消渴的物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究報(bào)道，小檗堿可通過激活A(yù)MPK抑制脂肪合成，改善胰島素抵抗[9]。AMPK為生物能量代謝關(guān)鍵分子，其所調(diào)控的AS160蛋白即為GLUT4關(guān)鍵激動(dòng)蛋白。因此本實(shí)驗(yàn)將通過高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞模擬糖尿病機(jī)體心臟高血糖環(huán)境，探討B(tài)BR對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞糖代謝功能以及心肌細(xì)胞損傷是否有改善作用，為BBR治療DCM提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng) H9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，使用Low Glucose DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境溫度37 ℃，5%CO2濃度。

1.2 藥品與試劑 小檗堿由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提取純化(小檗堿純度98%)；兔抗腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)單克隆抗體，兔抗磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(P-AMPK)單克隆抗體，兔抗丙酮酸脫氫酶(PDH)單克隆抗體，兔抗磷酸化糖代謝調(diào)節(jié)蛋白(P-AS160)，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購自CST公司;兔抗葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)，兔抗糖代謝調(diào)節(jié)蛋白(AS160)，購自Abcam公司；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自CST。Immobilon Western ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，PVDF膜購自Millpore；磷酸酶抑制劑，蛋白酶抑制劑購自Med Chem Express；Quickblock一抗稀釋液，Quickblock二抗稀釋液，SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒，PMSF，RIPA裂解液(強(qiáng))，BCA蛋白定量試劑盒，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，曲拉通X-100，DAPI染色液，青霉素-鏈霉素雙抗，胰酶細(xì)胞消化液購自碧云天；甘氨酸，Tris購自北京索萊寶；H9C2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM低糖培養(yǎng)基購自Hyclone；胎牛血清購自Gibco；CCK-8試劑盒，膜蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒購自上海貝博；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自南京維諾贊公司；鬼筆環(huán)肽購自Sigma；4%多聚甲醛購自Biosharp。

1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；壓力蒸汽滅菌器，上海申安儀器廠；金屬浴，杭州博日有限公司；超聲波清洗器，寧波新芝生物科技有限公司；電子分析天平，Mettler Toledo公司；純水機(jī)，力康儀器有限公司；超低溫冰箱，中科美菱有限公司；高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；搖床，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電泳裝置及轉(zhuǎn)膜裝置，上海天能科技有限公司；制冷劑，常熟市雪科電器有限公司；化學(xué)發(fā)光成像儀，上海培清科技有限公司。流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulter公司。熒光顯微鏡，德國Leica公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞計(jì)數(shù) 臺(tái)盼藍(lán)染色液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾備用。將細(xì)胞消化，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至EP管中吹打混勻，取10 μL細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)染液等體積混勻，吸取10 μL至細(xì)胞計(jì)數(shù)板。將計(jì)數(shù)板插入細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀，于顯示屏上可見活細(xì)胞呈中間通透圓點(diǎn)狀，死細(xì)胞為實(shí)心深色圓點(diǎn)狀，待機(jī)器自動(dòng)計(jì)算板中活細(xì)胞及死細(xì)胞數(shù)量，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.2 細(xì)胞活力檢測 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞加入培養(yǎng)基稀釋密度至1×105/mL。橫向加入96孔板各孔100 μL細(xì)胞懸液，邊緣36孔加入PBS。待細(xì)胞長至70%～80%，棄去原培養(yǎng)基，分別加入高糖(葡萄糖濃度50 mmol/L)及BBR(濃度分別為25、50、100 μmol/L)組，模型組(葡萄糖濃度50 mmol/L)和健康對(duì)照組干預(yù)24 h。各孔加入培養(yǎng)基體積十分之一體積即10 μL CCK-8試劑。4 h內(nèi)任意時(shí)間點(diǎn)讀板，選取吸光度(OD)值在1.0附近時(shí)分析。

1.4.3 細(xì)胞凋亡檢測 使用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測心肌細(xì)胞凋亡，分組為健康對(duì)照組，高糖誘導(dǎo)模型組及高糖條件下BBR(濃度分別為25、50、100 μmol/L)加藥組，心肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，控制1×106個(gè)細(xì)胞與500 μL工作液中，加入10 μL FITC染液，混勻避光室溫孵育10 min，再在每組加入5 μL PI染液同樣混勻避光室溫孵育10 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡百分率。

1.4.4 心肌細(xì)胞骨架觀察 將心肌細(xì)胞接種在24孔板中，分組同1.4.3分別加入高糖及小檗堿刺激24 h，棄去培養(yǎng)基，用37 ℃水浴中預(yù)熱的PBS洗2次，向各孔中加入150 μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫孵育10 min。吸出多聚甲醛，用PBS沖洗2次，加入200 μL 0.1%曲拉通，室溫孵育5 min后用PBS沖洗2次。向每孔中剛加入100 μL現(xiàn)配0.1%鬼筆環(huán)肽，室溫避光孵育30 min，于搖床上使用PBS洗3次，每次5 min，再加入100 μL DAPI染液，室溫避光孵育10 min，用PBS清洗2次，每孔加入200 μL PBS于熒光顯微鏡下觀察。

1.4.5 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，分組為高糖條件下BBR(25、50、100 μmol/L)濃度組，模型組，對(duì)照組，以1×108個(gè)/孔接種六孔板，加藥處理24 h后使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液及膜蛋白或胞漿蛋白提取試劑盒分別提取細(xì)胞總蛋白或膜蛋白，BCA定量測定蛋白濃度?？偟鞍着c膜蛋白分別加入1/4體積的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，總蛋白放入沸水煮沸5 min后備用，膜蛋白-80 ℃保存?zhèn)溆?。待SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)束，切膠轉(zhuǎn)PVDF膜，放入5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TPBS洗滌3次，置于配置好的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，ECL顯色，利用Image J軟件分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參考察各蛋白變化。

2 結(jié)果

2.1 BBR對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞存活率影響 圖1的CCK-8結(jié)果顯示，高糖刺激24 h后，與健康對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞存活率明顯下降；BBR(25、50、100 μmol/L)與高糖組相比可以逐步提高心肌細(xì)胞存活率，且呈濃度相關(guān)性。

注：與健康對(duì)照組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP<0.05

圖1BBR對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞存活率的影響(n=3)

2.2 BBR對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測心肌細(xì)胞凋亡率。圖2流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組相比，高糖能明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；高糖條件下BBR(25、50、100 μmol/L)加藥組與模型組比較，加藥組可以明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率，對(duì)心肌細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。

2.3 BBR對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞形態(tài)影響 鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞與正常組細(xì)胞相比，細(xì)胞呈肥大表現(xiàn)，BBR干預(yù)組(25、50、100 μmol/L)則可不同程度上改善心肌細(xì)胞肥大，使細(xì)胞形態(tài)趨于正常。見圖3。

2.4 BBR對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞AMPK、P-AMPK、AS160、P-AS160、PDH、GLUT4蛋白表達(dá)影響 AMPK蛋白是生物能量代謝關(guān)鍵分子，其調(diào)控AS160從而激活GLUT4向膜外轉(zhuǎn)運(yùn)，維持細(xì)胞正常葡萄糖攝取功能。PDH為丙戊酸脫氫酶，是催化丙酮酸不可逆的氧化脫羧為乙酰輔酶A的限速酶。

注：與健康對(duì)照組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP<0.05

圖2BBR對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響(n=3): A-E:Annexin V-FITC/PI雙重染色法檢測BBR對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響；F：不同組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比例的定量分析

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，高糖組P-AMPK、P-AS160、PDH、胞膜GLUT4含量明顯降低；與高糖組相比，BBR(25、50、100 μmol/L)可以不同程度提高心肌細(xì)胞內(nèi)P-AMPK、P-AS160、PDH、胞膜GLUT4的表達(dá)水平。見圖4。

3 討論

DCM作為糖尿病最為嚴(yán)重并發(fā)癥之一，病理特征表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化和PAS陽性的物質(zhì)浸潤，冠狀小動(dòng)脈基底膜增厚，心肌內(nèi)可見微血管病變[10]。糖尿病心血管病變中，DCM發(fā)病率最高，目前已成為老年糖尿病患者死亡的主要原因。由于發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前DCM的治療主要是通過控制血糖及血壓實(shí)現(xiàn)的，并沒有較為理想的藥物。因此進(jìn)一步探索DCM發(fā)病機(jī)制，以便制定更加有效合理的治療方案顯得尤為重要。

有研究顯示，慢性高血糖可引起心肌細(xì)胞損傷，高脂血癥會(huì)使脂肪酸大量進(jìn)入心肌細(xì)胞，進(jìn)而致使細(xì)胞脂肪酸氧化過載產(chǎn)生脂毒性[11]。因此心肌細(xì)胞的能量代謝障礙或許是DCM發(fā)病的重要原因。正常心肌細(xì)胞中，脂肪酸氧化與葡萄糖、乳酸代謝共同供能于心臟，保證其正常收縮功能[12-13]。而在高血糖環(huán)境中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性下降，影響細(xì)胞對(duì)葡萄糖跨膜運(yùn)輸速率，導(dǎo)致葡萄糖代謝提供ATP不足，進(jìn)而導(dǎo)致心臟供能不足。本實(shí)驗(yàn)則從改善心肌細(xì)胞葡萄糖代謝入手，觀察小檗堿是否可以通過AMPK-AS160通路刺激GLUT4的向膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而逆轉(zhuǎn)糖尿病狀態(tài)下的心臟糖代謝障礙。

本實(shí)驗(yàn)中，通過考察心肌細(xì)胞活力值，凋亡率，細(xì)胞形態(tài)觀察以及相關(guān)通路蛋白的表達(dá)分析小檗堿對(duì)HG誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得知小檗堿可一定程度提高HG條件下心肌細(xì)胞活力值，降低心肌細(xì)胞凋亡率，改善心肌細(xì)胞肥大[14]。通路蛋白中，小檗堿激活A(yù)MPK的磷酸化，從而刺激下游通路AS160，促進(jìn)GLUT4的質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

圖3 BBR對(duì)高糖誘導(dǎo)H9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)影響(×200)

注：與健康對(duì)照組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP<0.01，cP<0.05

圖4BBR對(duì)AMPK、AS160、PDH和GLUT4蛋白表達(dá)的影響(n=3)

這提示到小檗堿可通過激活A(yù)MPK通路改善HG誘導(dǎo)心肌細(xì)胞葡萄糖代謝障礙情況。但其通過何種方式進(jìn)入細(xì)胞影響AMPK還有待進(jìn)一步考證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)闡明了小檗堿可保護(hù)心肌細(xì)胞，降低HG誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡率，并激活A(yù)MPK磷酸化，促進(jìn)GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而起到治療DCM狀態(tài)下心肌細(xì)胞能量代謝障礙的作用，為治療DCM提供新思路。