徐婷娟，沈國棟，程民，吳新春，胡世蓮

[中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)老年醫(yī)學(xué)研究所，腫瘤免疫與營養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230001]

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率及死亡率[1]。全球癌癥狀況最新數(shù)據(jù)顯示2012年新增胃癌患者951 600例，因胃癌及其相關(guān)原因?qū)е碌乃劳龈哌_(dá)723 100人次[2-3]。近年來雖然內(nèi)鏡及治療策略如手術(shù)切除和化療取得了改進(jìn)，然而胃癌在全球的平均五年生存期仍僅維持在40%[4]。因此，探尋胃癌新的分子標(biāo)志物對于提高胃癌診斷的準(zhǔn)確性、提供胃癌治療的新靶點(diǎn)以及判斷患者預(yù)后有著重要意義[5]。

G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是一個(gè)超級(jí)膜蛋白受體家族，目前有30%～40%的藥物是將GPCR作為靶標(biāo)[6]。1998年，G蛋白偶聯(lián)受體35(GPR35)首次被發(fā)現(xiàn)在大鼠小腸中表達(dá)[7]，隨后的研究顯示GPR35在胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肺臟、肝臟、脾臟等多種組織中均有表達(dá)[8-10]。由于在相當(dāng)長時(shí)間里沒有發(fā)現(xiàn)其內(nèi)源性配體，GPR35一直被認(rèn)為是孤兒受體。近年來隨著內(nèi)源性和合成配體的發(fā)現(xiàn)，GPR35在多種疾病中的潛在作用愈發(fā)顯現(xiàn)[11-15]。有研究[16]報(bào)道，GPR35參與了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并且在胃癌組織中的表達(dá)上調(diào)，顯著高于癌旁組織。GPR35及其配體趨化因子17相互作用后能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[17]。

鑒于GPR35在腫瘤進(jìn)展中的作用，本文基于TCGA數(shù)據(jù)庫、Oncomine數(shù)據(jù)庫以及Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫，挖掘分析GPR35在胃癌中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的相關(guān)性，為深入研究GPR35在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)，以期為胃癌提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析GPR35在胃癌組織中基因組水平的改變 采用cBioportal分析工具(http://www.cbioportal.org/)對腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA,http://cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中GPR35基因改變頻率進(jìn)行分析。篩選條件如下：(1)在Select Studies中選擇Stomach Adenocarcinoma；(2)在Select Genomic Profiles中選擇Mutations和Copy number alteration;(3)輸入目的基因GPR35;(4)Submit Query。

1.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析GPR35在胃癌組織中mRNA水平的改變 運(yùn)用Oncomine數(shù)據(jù)庫(http://www.oncomine.org/)分析GPR35 mRNA水平在不同病理類型的胃癌與正常胃黏膜表達(dá)的差異性。篩選條件如下：(1)輸入目的基因GPR35；(2)在Primary Filters，Analysis Type中選擇Cancer vs.Normal Analysis，在Cancer Type中選擇Gastric Cancer；(3)在Dataset Filters，Data Type中選擇mRNA；(4)在datasets選擇Over-expression：Fold Change；(5)選擇展示圖形為箱式圖。

1.3 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析 GPR35 mRNA表達(dá)水平與胃癌患者生存期的關(guān)系 利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)的胃癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析。篩選條件如下：(1)選擇gastric cancer數(shù)據(jù)庫；(2)輸入目的基因GPR35；(3)Survival選擇OS；(4)Draw Kaplan-Meier plot。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0軟件包對胃癌組織中GPR35表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀測數(shù)據(jù)中的計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料中，正態(tài)資料行t檢驗(yàn)，偏態(tài)資料行秩檢驗(yàn)。生存分析方法為Kaplan-Meier乘積限法，組間比較為Log-Rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPR35在胃癌中表達(dá)水平改變的分析

2.1.1 GPR35在胃癌組織中基因組水平改變的分析 采用cBioportal分析工具對TCGA數(shù)據(jù)庫中GPR35的基因改變頻率進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在胃癌中，GPR35的改變形式主要表現(xiàn)為缺失。在TCGA，Provisional數(shù)據(jù)集中(共393例胃癌患者)，GPR35有3.30%的改變，其中有1.27%的突變(5/393)及2.03%的缺失(8/393)；在TCGA，PanCancer Atlas數(shù)據(jù)集中(共434例胃癌患者)，GPR35有2.99%的改變，其中有1.15%的突變(5/434)及1.84%(8/434)的缺失。

2.1.2 GPR35在胃癌組織中mRNA水平改變的分析 根據(jù)胃癌的發(fā)病機(jī)制和組織結(jié)構(gòu)的不同，Lauren分型將胃癌分為腸型和彌漫型。本研究分析了Oncomine數(shù)據(jù)庫中GPR35 mRNA水平在不同病理類型的胃癌與正常胃黏膜表達(dá)的差異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見圖1)，在DErrico數(shù)據(jù)集中，GPR35在腸型胃癌(26例)中的表達(dá)較正常胃黏膜(31例)升高1.446倍(P=0.003)，在彌漫型胃癌(6例)的較正常胃黏膜(31例)升高1.468倍(P=0.028)，在混合型胃癌(4例)較正常胃黏膜(31例)降低1.001倍(P=0.501)；在Cho數(shù)據(jù)集中，GPR35在腸型胃癌(20例)中的表達(dá)較正常胃黏膜(19例)升高2.477倍(P=2.67×10-4)，在彌漫型胃癌(6例)較正常胃黏膜(19例)升高2.015倍(P=8.91×10-4)，在混合型胃癌(10例)較正常胃黏膜(19例)升高2.324倍(P=6.70×10-4)。

圖1 應(yīng)用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析GPR35在胃癌組織中mRNA水平的改變：A為DErrico胃癌數(shù)據(jù)集，B為Cho胃癌數(shù)據(jù)集

圖2 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析不同時(shí)期GPR35與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性

表1 胃癌組織中GPR35的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.2 胃癌組織中GPR35的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 分析GPR35在胃癌組織中的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系(表1)，結(jié)果顯示，GPR35的表達(dá)與腫瘤的分化程度(χ2=25.060，P<0.001)、分期(χ2=7.039，P=0.008)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=14.927，P<0.001)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=28.615，P<0.001)以及HER2表達(dá)與否(χ2=153.840，P<0.001)顯著相關(guān)，而與患者性別、腫瘤浸潤深度、lauren分型和治療策略均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

2.3 GPR35 mRNA表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 為了進(jìn)一步明確GPR35 mRNA表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)：與GPR35低表達(dá)的胃癌患者相比，GPR35高表達(dá)的胃癌患者總生存期[HR=1.62 (1.36～1.93)，P=3.6×10-8]，首次進(jìn)展[HR=1.52 (1.24～1.86)，P=4.2×10-5]及進(jìn)展后生存期[HR=2.53(2.02～3.16)，P<1×10-16]均縮短，患者預(yù)后差(圖2)。

3 討論

眾所周知，惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是占腫瘤相關(guān)死亡90%以上的最致命的特點(diǎn)。同樣，侵襲轉(zhuǎn)移是胃癌最重要的特征[18]。胃癌的高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率所導(dǎo)致的遠(yuǎn)處器官或組織轉(zhuǎn)移，患者往往預(yù)后不良，生存率低。胃癌常見的轉(zhuǎn)移途徑分為四大類：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移、血道轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移最常見形式。接近50%的胃癌轉(zhuǎn)移是腹膜轉(zhuǎn)移，胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者生活質(zhì)量較差且生存期短，通常中位生存期僅為3～4個(gè)月，即使切除原發(fā)腫瘤也僅能將中位生存期提高到9～10個(gè)月。盡管越來越多的證據(jù)顯示化療可提高轉(zhuǎn)移性胃癌患者的生存期，但其預(yù)后仍然很差，中位總生存期約1年[19]。臨床工作中對胃癌術(shù)前術(shù)后轉(zhuǎn)移傾向的判斷仍然存在很大的困難，因此，深入研究胃癌轉(zhuǎn)移途徑的關(guān)鍵分子尤為重要，對提高患者術(shù)后生存質(zhì)量和生存率具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)Oncomine數(shù)據(jù)庫中GPR35 mRNA在不同分型(腸型、彌漫型和混合型)胃癌中的表達(dá)顯著高于正常胃黏膜，這與Okumura等[16]發(fā)現(xiàn)GPR35在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織的結(jié)果是一致的。但是在DErrico數(shù)據(jù)集中混合型胃癌組織的GPR35 mRNA表達(dá)較正常胃黏膜降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.501)，這可能與其臨床樣本量較小有關(guān)。本組進(jìn)一步分析了GPR35在胃癌組織中的表達(dá)水平與患者臨床病理之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GPR35的表達(dá)與腫瘤的分化程度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，即惡性程度越高的患者GPR35的表達(dá)越高。尤為重要的是，本研究顯示GPR35的表達(dá)與預(yù)后生存期之間具有顯著的相關(guān)性，高表達(dá)GPR35的患者預(yù)后較差，提示，GPR35在胃癌中有可能作為臨床預(yù)后判定指標(biāo)。

本研究存在一定的不足之處。TCGA、Oncomine和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫提供的均為mRNA水平的數(shù)據(jù)，不能完全真實(shí)地代表GPR35在蛋白水平表達(dá)的實(shí)際情況，故在后續(xù)的研究中應(yīng)結(jié)合免疫組織化學(xué)和Western blot技術(shù)在蛋白表達(dá)水平上分析驗(yàn)證GPR35在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機(jī)制，以期為胃癌治療提供新的靶標(biāo)。