李 越 王曉東 張小玲 易 夢 劉四喜

深圳市兒童醫(yī)院（廣東深圳 518000）

地中海貧血（thalassemia，TM）是全球累積人數(shù)最多的常染色體隱性單基因遺傳的慢性溶血性疾病。造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）是目前臨床根治重型β-TM 的唯一方法。肢帶型肌營養(yǎng)不良癥（limb-girdle muscular dystrophy，LGMD）是一組以近端?。ü桥鑾Ъ『图珉螏Ъ。┘o力為主要表現(xiàn)的高度異質(zhì)性遺傳性肌病[1]，總患病率為(1.63～ 5.00)/10萬[2]。LGMD尚缺乏有效的治療方法，目前干細(xì)胞移植為研究熱點，但其確切療效及安全性尚不明確。本文回顧分析1例應(yīng)用同胞HLA全相合HSCT治療的重型β-TM合并LGMD2型患兒的臨床資料，并復(fù)習(xí)國內(nèi)外文獻。

1 臨床資料

患兒，女，3歲5個月，體質(zhì)量13.3 kg?；純?1個月起出現(xiàn)乏力、納差，確診為β-TM，重型，CD 17 純合子突變，規(guī)律輸血及排鐵治療。3 歲時無誘因出現(xiàn)肌酶逐漸增高，右下肢行走稍乏力。父母為第3 代近親結(jié)婚。體格檢查：四肢肌肉無明顯萎縮，四肢近端及遠端肌力5 級。實驗室檢查：血清肌酸激酶（CK）20 802 IU/L。肌電圖示左側(cè)脛骨前肌、三角肌、近端肌呈混合性病損，遠端肌肌源性損害。左側(cè)股四頭肌肉活檢可見大量不透明肌纖維，少部分肌纖維變性、壞死及再生。肌肉組織免疫組化可見抗肌萎縮蛋白（dystrophin，Dys）表達。神經(jīng)肌肉病基因檢測示在LGMD 2 型相關(guān)的致病基因SGCB外顯子區(qū)域檢測到純合子突變（c.647T＞A）。檢索HGMD、Clinvar、dbSNP147等數(shù)據(jù)庫，均未見相關(guān)文獻報道。采用保守性預(yù)測軟件SIFT，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件Polyphen2和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件MutationTaste，預(yù)測該突變?yōu)閻盒酝蛔儯瑢?dǎo)致氨基酸改變p.L 216 X（亮氨酸＞終止），對蛋白的功能影響較大，符合ACMG相關(guān)指南的致病性級別，其父母及妹妹均為c.647T＞A的雜合突變（圖1）。

圖1 SGCB 基因測序結(jié)果

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒行造血干細(xì)胞移植。供者為患兒妹妹，2歲，HLA配型10/10位點匹配，經(jīng)嚴(yán)格體檢各項指標(biāo)符合造血干細(xì)胞供者標(biāo)準(zhǔn)。其接受粒細(xì)胞-集落刺激因子10 μg/(kg·d)，皮下注射，共5 天，第6 天采集骨髓血406 mL，獲得單個核細(xì)胞11.3×108/kg，CD34+細(xì)胞13.73×106/kg。預(yù)處理方案：環(huán)磷酰胺55 mg/(kg·d)，移植前第10～9天靜脈滴注；氟達拉濱40 mg/(m2·d)，移植前第2～6天靜脈滴注；白消胺3.2 mg/（kg·d），移植前第5～8天靜脈滴注；抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白（費森尤斯）7.5 mg/（kg·d），移植前第1～3天靜脈滴注。移植物抗宿主?。╣raft versus-host disease，GVHD）預(yù)防：甲氨蝶呤10 mg/(m2·d)，移植后第1天靜脈滴注，7 mg/(m2·d)，移植后3、6天靜脈滴注；環(huán)孢素3 mg/(kg·d)，移植前第1天起靜脈滴注，維持環(huán)孢素血藥濃度（200±50）ng/mL 后，改為7.5 mg/(kg·d)口服，并根據(jù)血藥濃度調(diào)整用藥劑量，若無GVHD 發(fā)生，移植后18 個月停藥；嗎替麥考酚酯30 mg/(kg·d)，移植后第1天口服，若無GVHD發(fā)生，移植后第30天停藥。移植后相關(guān)支持治療：更昔洛韋預(yù)防巨細(xì)胞病毒感染，伏立康唑預(yù)防真菌感染；血小板生成素300 U/(kg·d)，移植后第3～9天應(yīng)用；移植期間輸注輻照去白B型血小板和洗滌紅細(xì)胞,保持患兒血紅蛋白＞90 g/L，血小板＞20 ×109/L；肝素加熊去氧膽酸預(yù)防肝小靜脈閉塞癥。定期用聚合酶鏈反應(yīng)-短串聯(lián)重復(fù)序列分析（PCR-STR）檢測外周血供體和受體的短片段核苷酸重復(fù)序列，檢測供體干細(xì)胞植入狀態(tài)。移植后2年對患兒的血細(xì)胞計數(shù)、植入狀態(tài)、肌酸激酶水平、肌力等進行觀察。移植后中性粒細(xì)胞植入時間為移植后第15天，紅細(xì)胞和血小板植入時間均為移植后第16天。移植后第15、22天的植入證據(jù)提示受者體內(nèi)為混合嵌合狀態(tài)，嵌合率分別為87.4%和91%。第29 天后植入證據(jù)均提示完全供者嵌合。移植前后患兒血清酶無明顯下降，CK維持在20 000～25 000 IU/L，血清乳酸脫氫酶波動在1 000～1 500 IU/L；肌電圖示左側(cè)脛骨前肌、三角肌、近端三角肌未見明顯正峰電位，近端肌呈混合性病損，遠端肌肌源性損害?；純核闹×χ饾u下降，近期雙下肢肌力3～4級，雙上肢肌力4級，易摔倒。

2 討論

本例患兒是首次報道的同時患有重型β-TM 和LGMD2E。目前認(rèn)為HSCT是唯一可治愈重型β-TM的方法，且生活質(zhì)量明顯高于傳統(tǒng)輸血和去鐵治療的患者。自1981 年報道首例HSCT 治療TM 成功后，國際上應(yīng)用HSCT 治療重型β-TM 已超過4 000 例。歐洲血液及骨髓移植中心總結(jié)2001 年1 月－2010 年12月HSCT治療TM的臨床資料，1 061例18歲以下重型β-TM 患者接受HLA 全相合同胞供者HSCT，2 年總生存率和無病生存率分別為（91±1）%和（83±1）%[3]。

LGMD 與基因突變引起的肌細(xì)胞蛋白功能缺陷有關(guān)，受累蛋白涵蓋肌纖維所有結(jié)構(gòu)。根據(jù)遺傳方式分為常染色體顯性遺傳LGMD 1 型（LGMDlA～1 H）和常染色體隱性遺傳LGMD2型（LGMD2A～2Z）兩種類型。目前已鑒定出8個顯性基因和23個隱性基因位點突變[4]，兒童期發(fā)病的重度LGMD主要與SGCG、SGCA、SGCB或SGCD基因突變有關(guān)[5]，上述4個基因編碼的蛋白產(chǎn)物組成多聚糖復(fù)合物，有助于維持肌營養(yǎng)不良蛋白-肌營養(yǎng)不良聚糖復(fù)合物以及質(zhì)膜細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。LGMD2E屬肌聚糖蛋白病，致病基因為SGCB基因，其定位于染色體4q11，由6個外顯子組成。LGMD2E通常于兒童早期發(fā)病，近端肌受累為主，下肢更加明顯，伴翼狀肩胛、小腿肥大、巨舌癥、關(guān)節(jié)攣縮和脊柱側(cè)彎，多于青春期喪失行走能力，部分出現(xiàn)呼吸肌無力，晚期可出現(xiàn)心臟受累[6-7]。

LGMD不同亞型發(fā)病年齡、病情嚴(yán)重程度存在異質(zhì)性。LGMD 目前以綜合支持治療為主，缺乏有效改善病情的治療方案，干細(xì)胞移植及基因編輯有望成為有應(yīng)用前景的治療方法。干細(xì)胞移植可增強肌營養(yǎng)不良患者受損和退化肌細(xì)胞的再生能力[8]，但也存在諸多挑戰(zhàn)。首先，骨骼肌是人體最豐富的組織，因此需要大量可移植的祖細(xì)胞（每公斤數(shù)百萬）。其次，移植物植入的途徑顯著影響療效[9]，注射部位至受損肌肉組織的遷移率有限，動脈內(nèi)注射是另一種選擇，但僅限于有脈管遷移能力的細(xì)胞（如mesoangioblasts和CD 133+細(xì)胞）[10]，因此臨床上肌營養(yǎng)不良疾病的干細(xì)胞移植主要采取多點肌肉注射或聯(lián)合靜脈移植。此外，復(fù)雜的免疫反應(yīng)進一步損害細(xì)胞移植的結(jié)果，來自成肌細(xì)胞移植研究的數(shù)據(jù)表明，90%的供體細(xì)胞在移植后第一個小時內(nèi)通過細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)被清除[11]。最后，肌營養(yǎng)不良患者的肌肉處于持續(xù)炎癥狀態(tài)，免疫細(xì)胞浸潤可能會阻礙移植干細(xì)胞向功能性肌肉組織的廣泛遷移、增殖和分化。現(xiàn)在臨床上開展了多種干細(xì)胞移植治療LGMD，但結(jié)果有爭議。后續(xù)研究表明骨髓來源干細(xì)胞通過直接融合參與肌纖維形成，但體內(nèi)外均無法分化為肌細(xì)胞[12]。LGMD動物模型建立困難，缺乏動物實驗和基礎(chǔ)研究，有關(guān)LGMD的干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用報道較少。以“肢帶型肌營養(yǎng)不良”、“移植”為關(guān)鍵詞檢索維普數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫及中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫自建庫至2019 年8 月收錄的文獻，檢索到1篇文獻[13]。該文獻報道對33例LGMD患者進行骨髓干細(xì)胞的局部肌肉及經(jīng)靜脈雙重移植，移植后患者肌力增強，日常生活活動能力增加，臨床癥狀改善，肌酸磷酸激酶、乳酸脫氫酶值下降，肌酐值有升高，遠期療效仍有待進一步觀察。以“Limb-girdle muscular dystrophy”、“cell transplant”為關(guān)鍵詞檢索PubMed、Web of Science 數(shù)據(jù)庫自建庫至2019年8月收錄的文獻，僅檢索到1 篇文獻。該臨床試驗采用自體骨髓來源的單個核細(xì)胞經(jīng)鞘內(nèi)和肌肉特定運動點肌注治療150 例肌營養(yǎng)不良患者，其中20 例LGMD，聯(lián)合移植后強化康復(fù)訓(xùn)練，隨訪1年，86.67%患者肌肉力量和生活質(zhì)量得到改善[14]。本例重型β-TM 合并LGMD 2 E 患兒采用同胞HLA 全相合HSCT，評估移植后肌病改善情況，結(jié)果顯示移植后完全供者嵌合，造血功能恢復(fù)，但肌酶無改善，病情進展。這可能與本例患兒采取異基因HSCT 存在干細(xì)胞數(shù)量不足、免疫排斥以及遷移效率低有關(guān)，無法達到修復(fù)作用。

干細(xì)胞移植治療肌營養(yǎng)不良癥可能會短期增加患者肌力，提高生活能力，降低血清肌酶水平，改善肌電圖等指標(biāo)，但遠期療效有待觀察。目前已發(fā)現(xiàn)來自人體不同組織、不同發(fā)育階段具有肌源轉(zhuǎn)化能力的干細(xì)胞群，移植治療需克服的最大問題是植活和向受損肌肉組織的遷移，因此候選干細(xì)胞需具備強大的增殖能力和高效的肌源轉(zhuǎn)化率[15]。未來需不斷優(yōu)化移植策略，尤其是增強干細(xì)胞增殖、分化和遷移能力，并深入研究移植后的免疫反應(yīng)，或聯(lián)合基因療法[16]，以期改善肌營養(yǎng)不良患者長期生存質(zhì)量。