陸 璐 馬定遠(yuǎn) 成 建

1.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院生化教研室（江蘇南京 211800）；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心（江蘇南京 210004）

戊二酸血癥I型（glutaric aciduria type I，GA I）是一種少見的神經(jīng)退行性疾病，為常染色體隱性遺傳，全球發(fā)病率約為1/110000[1]?；純鹤钤缈捎? 月齡時(shí)出現(xiàn)癥狀，臨床表現(xiàn)多樣，主要為頭大畸形、肌張力異常、運(yùn)動(dòng)障礙等[2-4]，常在炎癥、發(fā)熱、嘔吐、腹瀉、疫苗接種、手術(shù)等應(yīng)激狀態(tài)下誘發(fā)。目前研究認(rèn)為，GA I 是由于戊二酰輔酶A 脫氫酶（glutaryl CoA dehydrogenase，GCDH）活性降低或缺失導(dǎo)致戊二酸、3-羥-戊二酸、戊烯二酸及戊二酰肉堿等有機(jī)酸在組織及體液內(nèi)異常蓄積造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷所致[5]。新生兒血液、尿液質(zhì)譜篩查可早期診斷GA I?；純喉氃诔霈F(xiàn)癥狀前限制賴氨酸、色氨酸的攝入，并且長(zhǎng)期堅(jiān)持飲食控制方案[6]，這必然會(huì)給患兒及家庭造成嚴(yán)重的心理、生理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此對(duì)于有再生育要求的患兒家庭，胎兒產(chǎn)前分子遺傳學(xué)診斷尤為重要。本研究對(duì)1 個(gè)GA I 家系進(jìn)行基因檢測(cè)，以明確致病變異，并為患兒家庭再生育提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。

1 臨床資料

患兒（先證者），男，4歲。6月齡不能抬頭、不能抓物。8月齡時(shí)當(dāng)?shù)蒯t(yī)院行尿液氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）檢測(cè)提示戊二酸濃度明顯升高（118.6 μmol/L，參考值0～4.0 μmol/L）；血高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS）檢測(cè)提示戊二酰肉堿濃度明顯升高（0.51 μmol/L，參考值0～0.20 μmol/L），游離肉堿濃度低（5.67 μmol/ L，參考值10.00～60.00 μmol/L）。4歲2個(gè)月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院遺傳醫(yī)學(xué)中心就診。體格檢查：體質(zhì)量12 kg，身高90 cm，不會(huì)說(shuō)話，頭圍明顯增大，四肢肌張力低，不能抬頭，不能站立，不能抓物。患兒出生時(shí)，父親24歲，母親25歲，均體健，否認(rèn)近親結(jié)婚，否認(rèn)遺傳病家族史?；純耗赣H于南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院就診時(shí)已停經(jīng)9周，確認(rèn)早期妊娠。

為進(jìn)一步對(duì)患兒進(jìn)行明確診斷及治療對(duì)患兒及其父母進(jìn)行基因檢測(cè)，所有檢測(cè)前均經(jīng)父母簽署知情同意書，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。采集患兒及其雙親外周血各2 mL，置抗凝管中－20℃凍存。取K 2 EDTA 抗凝外周血標(biāo)本0.2 mL，用全血DNA 提取試劑盒（美國(guó)Omega 公司）提取DNA。采用Ion AmpliSeqTM Custom Panel（Life Technologies）對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增。采用Ion Ampliseq Library Kit 2.0 和 Ion Xpress Barcode Adapter 1-16 Kit（Life Technologies）進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物加上序列標(biāo)簽及測(cè)序接頭。用Ampure Beads Kit 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，用Agilent2100 Bioanalyzer平臺(tái)進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)控，制備的文庫(kù)平均片段大小為300 bp 左右；采用Ion OneTouchTM System 和Ion PGMTM Hi-QTM View OT2 Kit（Life Technologies）進(jìn)行乳液PCR，在Ion OneTouch ES系統(tǒng)（Life Technologies）上對(duì)模板陽(yáng)性的磁珠顆粒（Ion Sphere Particles，ISPs）進(jìn)行富集；采用Ion PGMTM Hi-QTM View Sequencing Kit 和Ion 318TM Chip V2（Life Technologies）在Ion Torrent PGM 測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序；采用Ion Torrent Suite V4.2軟件進(jìn)行Ion Torrent數(shù)據(jù)提取、序列比對(duì)及單核苷酸位點(diǎn)變異（SNVs）和Indels提取，得到的SNVs和indels經(jīng)dbSNP 142數(shù)據(jù)庫(kù)和千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)濾后，檢索HGMD、LOVD 等數(shù)據(jù)庫(kù)及PubMed 相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行變異位點(diǎn)致病性分析。對(duì)原始BAM 文件應(yīng)用Integrative Genomics Viewer（IGV）軟件進(jìn)行比對(duì)讀序（reads）的可視化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患兒GCDH基因c.395 G＞A（p.R132Q）、c.769C＞T（p.R257W）復(fù)合雜合型突變（圖1）。GCDH基因第6 外顯子編碼區(qū)c.395 G＞A（p.R132Q）錯(cuò)義突變HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)ID為“CM000391”，SFIT軟件預(yù)測(cè)為有害；GCDH基因第8外顯子編碼區(qū)c.769C＞T（p.R257W）錯(cuò)義突變HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)ID為“CM980863”，SFIT軟件預(yù)測(cè)為有害。

圖1 患兒GCDH 基因測(cè)序結(jié)果

根據(jù)患兒變異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)2 對(duì)P C R 引物。①GCDH-e6F：TCC TTA TTC AGC CCT GTC TCT T，GCDH-e6R：GCG TTC ATC GTC CAC TTC AA；②GCDH-e8F：CCA CTA CAA CTC ATC CAA CAA GA，GCDH-e8R：AGC GAG ACG GTC ACC AAA T。對(duì)GCDH基因第6、8 外顯子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳純化后，用ABI 3130基因分析儀進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果用Lasergene 軟件包中的SeqBuilder 程序進(jìn)行序列比對(duì)，GCDH基因標(biāo)準(zhǔn)參照序列為NM_000159.3。經(jīng)Sanger 測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，患兒母親攜帶c.769 C＞T（p.R 257 W），基因型為雜合；患兒父親攜帶c.395 G＞A（p.R 132 Q），基因型為雜合（圖2）?；純篏CDH基因同時(shí)攜帶2 個(gè)已明確報(bào)道過(guò)的致病性突變（分別遺傳自父親、母親），為復(fù)合雜合型突變，該基因型改變符合患兒臨床表型及血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果，因此患兒明確診斷為戊二酸血癥I型。

圖2 患兒父母及胎兒GCDH 基因測(cè)序結(jié)果

由于患兒母親已再次懷孕，經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理審核及家屬知情同意，于孕18 周進(jìn)行羊膜腔穿刺，抽取羊水標(biāo)本，提取DNA，進(jìn)行產(chǎn)前基因檢測(cè)。常規(guī)經(jīng)腹羊膜腔穿刺抽取羊水30 mL，其中20 mL 行羊水培養(yǎng)，10 mL 行羊水標(biāo)本母體污染檢測(cè)及基因檢測(cè)。羊水離心后用1 mL PBS液洗滌2次，細(xì)胞沉淀用Lab-Aid 820核酸提取儀（Lab-Aid核酸分離試劑盒，廈門致善公司）提取DNA 樣本。采用21 三體和性染色體多倍體檢測(cè)試劑盒（廣州達(dá)安基因公司）對(duì)胎兒羊水細(xì)胞基因組DNA 及其父母外周血基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)7個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）位點(diǎn)進(jìn)行分析，以排除母體DNA 的污染。7 個(gè)STR 位點(diǎn)包括6 對(duì)STR 位點(diǎn)（分別為D21S1435、D21S11、D21S1411、DXS981、DXS 6809、X 22）與1 個(gè)性別特異性（AMXY）位點(diǎn)。STR 檢測(cè)結(jié)果表明未見母體污染。對(duì)羊水標(biāo)本進(jìn)行Sanger測(cè)序檢測(cè)，結(jié)果顯示，胎兒GCDH基因c.395位點(diǎn)、c.769位點(diǎn)均未發(fā)生突變（圖2）。胎兒足月正常分娩，出生后取新生兒足根血干血片、尿液行血LC/MS及尿GC/MS檢測(cè)，結(jié)果顯示，新生兒戊二酰肉堿濃度、游離肉堿濃度、戊二酸濃度均在正常范圍。電話回訪，目前10 月齡，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院體檢顯示生長(zhǎng)發(fā)育情況良好，無(wú)異常癥狀。

2 討論

GCDH 是黃素蛋白家族中的一種酰基輔酶A 脫氫酶（acyl-CoA dehydrogenase，ACD），除了催化底物脫氫以外，它還可以催化底物乙酰輔酶A 脫羧基[3]。GCDH 的活性形式是由4 個(gè)單體構(gòu)成的同源四聚體，每個(gè)單體是由438 個(gè)氨基酸組成的前體蛋白，其中44 個(gè)N-末端氨基酸是線粒體定位信號(hào)，在進(jìn)入線粒體后會(huì)被切除。GCDH 單體的二級(jí)結(jié)構(gòu)分成3 個(gè)結(jié)構(gòu)域：N-末端α-螺旋（R 45～Q 167）、C-末端α-螺旋（S 282～K 438）及中間的β-片層（L 168～S 281），N-末端、C-末端α-螺旋都和右側(cè)配體形成交互界面，中間的β-片層和左側(cè)的配體相互作用[7]。在GCDH四聚體中，每個(gè)單體的中間β-片層、C-末端α-螺旋及鄰近單體的C-末端α-螺旋形成一個(gè)空腔，空腔中通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合1 分子黃素腺嘌呤核苷（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD），從而形成一個(gè)有催化活性的GCDH四聚體[8]。在線粒體基質(zhì)中，同源四聚體GCDH 直接與其他線粒體基質(zhì)蛋白接觸形成多酶復(fù)合體，例如二氫硫S-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（dihydrolipoamide S-succinyltransferase，DLST）、含有異源二聚體電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白FAD，協(xié)同完成催化作用。多酶復(fù)合體中DLST和GCDH的連貫催化作用是戊二酰輔酶A氧化脫羧基反應(yīng)及維持細(xì)胞內(nèi)氨基酸穩(wěn)定的先決條件[9]。任何影響GCDH同源四聚體、多酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)形成的氨基酸殘基改變均可能導(dǎo)致GCDH 催化活性降低或降解加速，使得細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)底物堆積，最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)與神經(jīng)系統(tǒng)損傷相關(guān)的臨床表型。在HGMD（The Human Gene Mutation Database）公共版數(shù)據(jù)庫(kù)中，目前共有135 種可導(dǎo)致氨基酸改變的錯(cuò)義/無(wú)義點(diǎn)突變（截至2018 年1 月，專業(yè)版HGMD 數(shù)據(jù)共有171 種錯(cuò)義/無(wú)義點(diǎn)突變），其中38種氨基酸改變是位于GCDH單體N-末端α-螺旋結(jié)構(gòu)域（R45～Q167），35種位于中間的β-片層（L168～S281）結(jié)構(gòu)域，62種位于C-末端α-螺旋結(jié)構(gòu)域（S282～K438），這種C末端突變明顯占多的分布模式可能與C-末端α-螺旋結(jié)構(gòu)域是GCDH主要的催化活性中心有關(guān)。

本例患兒為GCDH c.395 C＞T（p.R 132 Q）、c.769 C＞T（p.R 257 W）復(fù)合雜合突變，這2 個(gè)突變均為已報(bào)道過(guò)的致病突變[10-11]。R 132 位于GCDH 單體N-末端α-螺旋結(jié)構(gòu)域D 區(qū)段，R 257 位于GCDH 單體中間β-片層結(jié)構(gòu)域6、7 區(qū)段中間。R（精氨酸）是極性正電荷親水氨基酸；Q（谷氨酰胺）是極性不帶電荷氨基酸，親水性明顯低于R；W（色氨酸）是非極性疏水氨基酸。已有研究者通過(guò)軟件分析GCDH 的3 D結(jié)構(gòu)，顯示p.R 132 Q 可影響GCDH 單體四聚化[12]。在氨基酸組成、折疊成特定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的過(guò)程中，帶電荷親水氨基酸多位于立體結(jié)構(gòu)的表面，疏水氨基酸多位于內(nèi)部。p.R132Q、p.R257W突變可能因此改變了GCDH單體的二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊，進(jìn)而阻礙了同源四聚體的形成。同時(shí)，p.R 132 Q、p.R 257 W 突變可能導(dǎo)致GCDH單體蛋白分子表面的靜電點(diǎn)位改變，使得GCDH 單體四聚化過(guò)程及多酶復(fù)合體的聚合過(guò)程受阻。以上分子機(jī)制推斷需要進(jìn)行定點(diǎn)突變后的蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析、蛋白生化活性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)手段來(lái)驗(yàn)證。受實(shí)驗(yàn)室的條件所限，本例患兒未能行以上驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

GA I是一種可治療的疾病，但是在出現(xiàn)嚴(yán)重不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀之前，患兒不會(huì)表現(xiàn)出特異性癥狀，這使得早期臨床診斷很困難。目前，許多國(guó)家和地區(qū)已將GA I 加入到新生兒篩查項(xiàng)目中，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合GCDH基因突變檢測(cè)方案可極大地提高診斷的敏感性和特異性[13-14]。同時(shí)，對(duì)于有再生育要求的患兒家庭來(lái)說(shuō)，GCDH基因突變分子遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)使得產(chǎn)前診斷成為可能。本研究成功確定了GD I 家系GCDH基因致病突變位點(diǎn)，并為患兒母親再生育實(shí)施了產(chǎn)前分子遺傳學(xué)診斷，確保新生嬰兒的健康。

綜上，分子遺傳學(xué)檢測(cè)是GA I有效的確診方法，應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜篩查技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)及產(chǎn)前診斷相結(jié)合的聯(lián)合診療方案可有效的減少GA I患兒的出生。