丁華杰，葉云，安歡，趙彬樂，羅容青，鐘英英*

廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院（柳州 545006）

葡萄是一種雙子葉植物，它不但營養(yǎng)豐富、用途廣泛，而且色美、味甜，是果中佳品[1]。研究表明，葡萄果皮中主要有花色素類、白黎蘆醇及黃酮類等[2]。白藜蘆醇（3, 5, 4-三羥基二苯乙烯），又名芪三酚，是目前研究最為廣泛的多酚類化合物之一，白藜蘆醇含有多種重要的生物活性物質(zhì)，它的保健作用和藥用價值已受到人們的普遍重視。其具有抗癌[3]、抗炎[4]、改善血管功能[5]、延長壽命、延緩衰老[6-7]等多種藥理作用。

白藜蘆醇的非生物誘導(dǎo)劑有許多，比如臭氧、紫外線、氯化鋁、乙磷鋁、過氧化氫、溫度等，這些因素有些可以提高白藜蘆醇的含量，但有些又可以降低白藜蘆醇的含量，具體的影響條件還不是十分清楚。試驗以葡萄皮為原料，將果皮晾干備用，通過改變過氧化氫、氯化鋁、硝酸銀等六個因素，探討它們對葡萄皮中白藜蘆醇含量的影響。通過對葡萄皮中提取白藜蘆醇，可以更好地開發(fā)葡萄的利用價值，變廢為寶，為農(nóng)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供一條新思路。

1 試驗材料及預(yù)處理

1.1 試驗材料

試驗材料購于廣西柳州市潭中市場，葡萄品種為紅地球，挑選質(zhì)地均一、沒有病蟲害、外觀完整、無機械損傷的葡萄。清洗，晾干，剔除果肉，果皮備用。每組處理3次重復(fù)。

1.2 試驗試劑

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，購于成都曼思特生物科技有限公司；分析純硝酸銀、過氧化氫、鹽酸、氫氧化鈉，均購于廣東光華科技股份有限公司；分析純氯化鋁，購于成都市科龍化工試劑廠。

1.3 材料預(yù)處理

1) pH處理：pH的處理參照呂中等[8]的方法，用38%濃鹽酸和10 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，使pH為3，5，8，11和13，然后用不同pH的溶液進(jìn)行浸泡，浸泡1 h。

2) 過氧化氫溶液處理：過氧化氫處理參考Chung等[9]的方法，過氧化氫濃度為1.25%，2.5%，5%和10%，處理方式為浸泡處理，處理1 h。

3) 氯化鋁溶液誘導(dǎo)：氯化鋁處理參照Adrian等[10]的方法，氯化鋁的濃度為1，7，30，60，90和120 μ g/mL，處理方式為酸性溶液浸泡處理，浸泡處理1 h。

4) 硝酸銀溶液誘導(dǎo)：硝酸銀的處理參考張真等[11]的方法，硝酸銀的濃度為1，5，10，15，20和25 μg/mL，處理方式為浸泡處理，處理1 h。

5) 低溫誘導(dǎo)：將原料置于-20 ℃冰箱中1 h。

6) 紫外線誘導(dǎo)：紫外線處理參照亓桂梅等[12]的方法，UV（254和310 nm照射60 min）處理原料1 h。

7) 熱休克誘導(dǎo)：熱休克處理根據(jù)熱休克反應(yīng)原理設(shè)置溫度，設(shè)置溫度40，50和60 ℃，分別置于這3個溫度的烘箱中處理1 h。

2 試驗方法

2.1 白藜蘆醇的提取

取上述處理過的葡萄皮置于50～60 ℃的烘箱中烘干，分別稱取2.00 g置于圓底燒瓶中，加入40 mL乙醇溶液置于磁力攪拌器中提取2 h，趁熱過濾，所得濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收乙醇直至剩余液體體積約為5 mL，定容至10 mL。在306 nm處測定溶液的吸光度。

2.2 白藜蘆醇的含量測定

取少許白藜蘆醇置于水浴鍋中蒸干，溶于乙醇溶液中，采用薄層色譜法對白藜蘆醇進(jìn)行定性分析[13]。展開劑為正丁醇-醋酸-水（4︰1︰5，V/V），在365 nm的紫外燈下觀察熒光。觀察對照品溶液和供試品溶液的熒光位置。

2.3 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取2.00 mg白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇定容至10 mL。配制質(zhì)量濃度為2，4，6，8，10和12 μ g/mL的對照品溶液，以乙醇作參比溶液，測定306 nm處的吸光度，以濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按式（1）計算白藜蘆醇的含量。

式中：m為白藜蘆醇的濃度，μg/mL；V為溶液體積，mL；D為樣品稀釋倍數(shù)；G為樣品質(zhì)量，g。根據(jù)公式算出含量，求出三組平行試驗的平均值。

3 試驗結(jié)果與分析

3.1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，白藜蘆醇線性回歸方程為A=0.184 8C+0.042 3，R2=0.999 1。標(biāo)準(zhǔn)曲線在白藜蘆醇濃度0～12 μ g/mL范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。重復(fù)3次，取平均值。

3.2 不同濃度的過氧化氫溶液對白藜蘆醇含量的影響

如圖2所示，當(dāng)過氧化氫濃度在0～5%時，白藜蘆醇的含量呈直線上升的趨勢；當(dāng)過氧化氫濃度大于5%時，白藜蘆醇的含量逐漸降低；當(dāng)過氧化氫濃度為5%時，白藜蘆醇的含量最大，表明過氧化氫濃度的增加，有利于促進(jìn)葡萄中白藜蘆醇含量的累積。該試驗結(jié)果與田春芳等[14]的研究趨勢一致。

圖1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同濃度過氧化氫對白藜蘆醇含量的影響

3.3 不同濃度氯化鋁溶液對葡萄皮中白藜蘆醇含量的影響

由圖3可知，當(dāng)氯化鋁濃度為0～90 μg/mL時，葡萄皮中白藜蘆醇的含量逐漸升高；當(dāng)氯化鋁濃度大于90 μg/mL時，葡萄皮中白藜蘆醇的含量急劇降低；當(dāng)氯化鋁濃度為90 μg/mL時，葡萄皮中白藜蘆醇的含量達(dá)到最大。這與黃方愛等[15]得到的研究趨勢一致。當(dāng)氯化鋁濃度為90 μg/mL時，最有利于葡萄皮中白藜蘆醇的累積。

圖3 不同濃度的氯化鋁對白藜蘆醇含量的影響

3.4 不同濃度的硝酸銀溶液對白藜蘆醇含量的影響

如圖4所示，在0～10 μg/mL范圍內(nèi)，隨著硝酸銀濃度的增大，葡萄皮中白藜蘆醇的含量也逐漸增大；當(dāng)硝酸銀濃度大于10 μg/mL時，葡萄皮中白藜蘆醇含量的增加呈現(xiàn)下降的趨勢，但其含量還是在增長，但增長比較緩慢；當(dāng)硝酸銀濃度大于10 μg/mL時，白藜蘆醇含量的增長明顯下滑。這與張真等[11]的研究趨勢一致。故最適白藜蘆醇累積的硝酸銀濃度為10 μ g/mL。

圖4 不同濃度的硝酸銀對白藜蘆醇含量的影響

3.5 熱休克對白藜蘆醇含量的影響

由圖5可知，當(dāng)溫度為25～50 ℃時，葡萄皮中白藜蘆醇的含量是上升的；50 ℃時，白藜蘆醇的含量最大，是葡萄皮中白藜蘆醇累積的最適溫度。繼續(xù)上升溫度，葡萄皮中白藜蘆醇的含量也是升高的，只是上升的趨勢有所減慢。此次試驗結(jié)果與李景明[16]的研究結(jié)果一致，只是在含量上有些許差別。

圖5 熱休克對白藜蘆醇含量的影響

3.6 低溫對白藜蘆醇含量的影響

從圖6可以看出，低溫對葡萄皮中白藜蘆醇含量有抑制作用，該試驗結(jié)果與李景明[16]的研究一致，在低溫條件下，白藜蘆醇的含量都是有所下降的。

圖6 低溫對白藜蘆醇含量的影響

3.7 不同紫外燈波長對白藜蘆醇含量的影響

如圖7所示，當(dāng)波長為254 nm時，白藜蘆醇的含量相對于對照時白藜蘆醇的含量是升高的，而在310 nm時，白藜蘆醇的含量相對于對照是降低的。這與劉竹蘭等[17]的研究趨勢是一致的，說明了此次試驗的準(zhǔn)確性。

圖7 不同波長對白藜蘆醇含量的影響

4 結(jié)論

試驗研究了過氧化氫等六個影響因子對葡萄皮中白藜蘆醇含量的影響。堿性條件、過氧化氫濃度為5%、氯化鋁濃度為90 μg/mL、硝酸銀濃度為10 μg/mL、紫外燈波長為254 nm、熱休克的條件，有利于葡萄皮中白藜蘆醇含量的增加。而低溫則不利于葡萄皮中白藜蘆醇的累積。